Isolamento de exossomos: uma técnica para separar exossomos do plasma de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas

Resumo

Fonte: Giallombardo, M., et al. Análise de miRNA exossômico no plasma de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) por meio de qPCR: uma ferramenta de biópsia líquida viável. J. Vis. Exp.(2016).

Os exossomos isolados no plasma podem ser usados como uma forma não invasiva e repetível para a detecção e acompanhamento dos biomarcadores para detecção precoce e progressão da doença. Este vídeo descreve o protocolo para a separação de exossomos das amostras de plasma de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas, que pode ser usado para extrações de DNA e proteínas.

Protocolo

1. Isolamento de exossomos

Nota: O isolamento dos exossomos das amostras de plasma, foi realizado com um kit comercial, de acordo com o protocolo do fabricante e adicionando tratamento com RNAse: (todas essas etapas devem ser realizadas com equipamentos de proteção individual e ambiental e seguindo procedimento legal específico para manipulação de amostras biológicas).

1. Retirar 1 ml de plasma de cada amostra, conservada a -80 °C, e colocá-la sobre gelo.
2. Centrifugar a amostra a 2.000 × g durante 20 min à RT; esta passagem é obrigatória para remover as células e os detritos.
3. Transferir o sobrenadante que contém o plasma limpo para um novo tubo de 1,5 ml.
4. Centrifugue o novo tubo a 10.000 × g por 20 min em RT.
5. Transferir o sobrenadante que contém o plasma limpo para um novo tubo de 1,5 ml.
6. Adicionar 100 ng/ml de RNAse ao sobrenadante e incubar o tubo a 37 °C durante 10 minutos para degradar os RNAs circulantes.
7. Transfira todo o plasma tratado para um novo tubo de 2 ml e adicione 0,5 volume de 1x PBS.
8. Vortex a amostra para misturar as soluções.
9. Adicionar 0,05 volumes de solução de proteinase K (incluir no kit) à amostra.
10. Vortex a amostra e depois incubar a 37 °C durante 10 min.
11. Adicionar 0,2 volume de tampão de precipitação de exossomas à amostra e misturar as soluções por inversão.
12. Incubar a amostra a 2 °C a 8 °C durante 30 min e, em seguida, centrifugar a amostra a 10.000 × g durante 5 min a RT.
13. Aspire e descarte o sobrenadante. O pellet contém os exossomos isolados.
14. Adicione o tampão selecionado ao pellet do exossomo para ressuspender os exossomos. A seleção do buffer depende da análise a jusante planejada, neste caso:
    1. Adicione 100 μl de 1x PBS para realizar a análise MET.
    2. Adicione 346,5 μl de tampão de lise específico para extração de RNA (do kit comercial) (CUIDADO: perigo químico).
    3. Adicione 100 μl de tampão de lise para extração de proteínas (Tris-HCl 50 mM, pH 7,6 - NaCl 300 mM - Triton X-100 0,5% - PMSF 1 mM - Leupeptina / Aprotinina 10 μg / ml) para realizar a análise de Western Blotting. (CUIDADO: perigos químicos).
15. Armazenar os exossomas ressuspensos a −20 °C.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de isolamento total de exossomos (de plasma)	Invitrogen	4484450	Use o tratamento com proteinase K
Ribonuclease A	Sigma-Aldrich	R4875-100MG
Mini kit RNAspin Illustra 50	GE HealthCare	25-0500-71