FISH de DNA 3D: uma técnica para localizar um gene específico em um cromossomo

Neste artigo

Resumo

Fonte: Gallerani, G. et.al. Caracterização de células tumorais usando um fio médico para capturar células tumorais circulantes: uma abordagem 3D baseada em imunofluorescência e DNA FISH. J. Vis. (2017).

O isolamento e caracterização de células tumorais circulantes (CTC) do sangue de pacientes com câncer é um tipo de biópsia líquida não invasiva e associada à recidiva e progressão da doença. Este vídeo descreve a técnica de hibridização in situ de fluorescência de DNA (DNA FISH) em CTCs capturadas em um fio médico, para estudar um gene específico de interesse.

Protocolo

1. 3D DNA-FISH Dia 2

CUIDADO: Atenção especial deve ser dada à alta temperatura dos instrumentos e da câmara úmida.

Configure o forno de hibridização e o forno de calor seco (~ 3 h antes de iniciar o protocolo DNA-FISH). Defina o forno de hibridização a 75 °C, ajuste o forno de calor seco a 37 °C e resfrie a solução SSC a 0,4× (pH = 7,0 ± 0,1) a 4 °C.
nota: O status de pH dos tampões FISH é crítico e deve ser de 7,0 ± 0,1.
Lave o fio 3 vezes em solução SSC 0,4× gelada.
nota: Mantenha o fio no escuro para evitar o fotobranqueamento com fluorocromo durante os procedimentos a seguir.
Seque por 10 min no escuro sob a hotte.
Vortex e gire a sonda por 5 s.
Coloque 10 μL da sonda nos microtubos de vidro. Cubra com filme de laboratório.
Gire os microtubos da seguinte maneira: envolva o microtubo em um absorvente seco, coloque papel em um tubo de 50 mL e gire brevemente.
Coloque cuidadosamente o fio seco no microtubo e insira o batente de fio. Selo com cimento de borracha.
cuidado: As próximas duas etapas envolvem altas temperaturas. Use luvas de proteção.
Coloque o fio em uma câmara úmida escura no forno de hibridização por 8 min a 75 ° C para obter a desnaturação completa do DNA.
Mova a câmara úmida para um forno de calor seco a 37 ° C durante a noite.

2. 3D DNA-FISH Dia 3

Coloque um frasco de coloração deslizante com solução de SSC 0,4× em banho-maria e ajuste a 72 °C.
Verificar a temperatura da solução de 0,4× SSC até atingir 72 ± 1 °C.
Prepare dois copos de vidro, um com 2× SSC + 0,05% de solução Tween (pH = 7,0 ± 0,1) e o segundo com água destilada.
Remova a câmara úmida do forno de calor seco, remova cuidadosamente o cimento de borracha da rolha de arame usando uma pinça e retire o arame.
nota: Puxe cuidadosamente a extremidade não revestida do fio através da rolha IN, tomando cuidado para não danificar a ponta funcionalizada.
Mergulhe o fio na solução SSC 0,4× por 2 min a 72 °C.
Lave o fio em 2× SSC + solução de interpolação a 0,05% por 30 s em RT.
Lave o fio em água destilada em RT.
Seque o fio sob a hotte durante 10 min no escuro.
Preparar uma solução-mãe DAPI de 1,43 μM em 2 ml de PBS a 1×.
Incube a ponta funcionalizada do fio com solução DAPI em um frasco de 2 mL por 1 h no escuro em RT.
Enxágue o fio duas vezes em 1× PBS e seque ao ar.

3. 3D observação e análise microscópica

Posicione o fio no suporte do fio. Insira cuidadosamente a ponta funcionalizada através do ponto de entrada do suporte especial, até que a ponta corresponda ao ponto de acoplamento. Tenha cuidado para não danificar a ponta funcionalizada (Figura 1a).
Coloque o suporte especial na platina do microscópio. Ajuste o foco do microscópio usando uma lente de 20×. Primeiro concentre-se grosseiramente no suporte especial e, em seguida, ajuste com precisão nas células que parecem brilhantes no canal DAPI.

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Resultados

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Figura 1: Fio funcionalizado, arranjo esquemático das sondas de separação ALK, esquema de padrões esperados de rearranjo ALK e suporte especial.(a) As caixas vermelhas destacam as três partes principais do fio: ponta funcionalizada, rolha de fio e ponta não funcionalizada. A ponta funcionalizada é a parte mais delicada do fio e não deve ser tocada durante o manuseio ...