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1. Fixação e processamento das fatias de tecido
- Levante cuidadosamente a referência de 0 h não cultivada ou a fatia cultivada em papel de filtro embebido em PBS.
- Para fazer isso, adicione 2-3 mL de PBS em cima de um papel de filtro colocado em uma placa de 10 cm. Coloque a fatia em cima do papel de filtro e retire o papel de filtro usando uma pinça.
- Transfira o papel de filtro para um histocassete e adicione uma gota de hematoxilina diluída (1:1 em água deionizada) sobre a fatia de tecido para marcar visivelmente a posição da fatia durante as etapas de processamento subsequentes (Figura 1D).
- Feche o e transfira-o para uma solução de formalina tamponada neutra a 4%. Fixar os tecidos durante a noite a 4 °C.
nota: Ao colocar a fatia em cima do papel de filtro, certifique-se de que a parte superior da fatia esteja voltada para cima; Isso é necessário para seguir a seção superior, intermediária e inferior de uma fatia durante o corte e a análise, conforme descrito na etapa 2.3.
- No dia seguinte, transfira os para EtOH a 70% e prossiga imediatamente com a etapa de processamento de tecido com incorporação de parafina.
- Antes do processamento do tecido, lave as histocassetes em 100% EtOH 2x por 10 min cada. Nesse caso, use uma estação de micro-ondas para processamento de tecidos. Selecione o programa utilizado para 1 mm de espessura de tecido e siga as instruções fornecidas no manual (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf).
nota: Ao usar outras máquinas de processamento de tecidos, use o programa adequado para amostras de tecido fino.
- Para inclusão em parafina, abra uma histocassete e use um bisturi para levantar cuidadosamente a fatia do papel de filtro. Descarte o papel de filtro e transfira a fatia para um molde contendo parafina líquida.
- Pressione o tecido contra a parte inferior do molde de incorporação, por exemplo, com um peso plano, para garantir um corte uniforme. Coloque a parte inferior do histocassete em cima do molde, adicione parafina líquida em cima dele. Deixe o molde esfriar em patê frio por 30 min e separe o molde do bloco de parafina.
nota: Como alternativa à incorporação horizontal, é possível incorporar a fatia do tumor verticalmente, posicionando a fatia na posição vertical. As seções verticais permitem prontamente a análise de gradientes na viabilidade ou expressão de marcadores funcionais em uma única seção. A análise de gradiente com fatias embutidas horizontalmente requer o corte de parafina, conforme descrito na etapa 2.2.
2. Processamento e Análise de Tecidos Fixados em Formol e Embebidos em Parafina (FFPE)
- Preparar secções finas de 4 μm dos blocos de fatias de tecido FFPE utilizando um micrótomo. Ao seccionar, ajuste o ângulo do bloco para que a superfície do bloco fique orientada horizontalmente em relação à lâmina; Isso é necessário para obter cortes uniformes em todo o tecido.
- Para permitir a captura de um potencial gradiente de viabilidade induzido por cultura, migração celular através das fatias ou gradientes na expressão de biomarcadores entre fatias cultivadas, colete seções das camadas superior, central e inferior de cada uma das fatias de tecido em lâminas de objetos, conforme explicado abaixo.
- Recolha secções sequenciais de tecido da fatia de tecido embebido em parafina primeiro na parte superior das lâminas de vidro. Continue coletando as seções das camadas mais profundas do tecido para o meio, seguidas pela parte inferior das lâminas de vidro (Figura 1E).
nota: Para acomodar três seções em uma lâmina de vidro, corte o excesso de parafina ao redor da fatia de tecido incorporada.
- Deixe as seções secarem durante a noite a 37 °C e prossiga com a coloração H&E ou imuno-histoquímica conforme descrito abaixo.
nota: A perda de antigenicidade pode ocorrer quando as seções FFPE são armazenadas em altas temperaturas ou por longos períodos de tempo. Recomenda-se que as seções de parafina sejam armazenadas a 4 °C, e as análises de IHC devem ser realizadas dentro de 6 meses após a secção.
- Para coloração H&E, desparafinize e reidrate as seções de parafina da seguinte forma: xileno 3x por 5 min, 100% EtOH 3x por 1 min, 96% EtOH 2x por 1 min, 70% EtOH 1 x 1min e água deionizada 2x por 1 min.
- Incube as seções em solução de hematoxilina recém-filtrada por 10 min e lave em água corrente por 5 min. Mergulhe as seções em álcool ácido (HCl a 1% em EtOH a 70%) por 2 vezes e lave em água corrente por 5 min, seguida de incubação com eosina a 0,5% por 2 min.
- Após a etapa de eosina, desidrate as lâminas imergindo as lâminas em soluções de álcool e xileno, da seguinte forma: 96% EtOH 2x por 15 s, 100% EtOH 3x por 30 s, xileno 3x por 1 min. Por fim, incorpore as seções em um meio de montagem à base de xileno.
