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1. Preparação de Células e Meio
- Preparar o meio utilizando 240 ml de meio de Dubecco modificado de Iscove (IMDM) e 50 ml de soro fetal bovino. Não descongele o soro fetal bovino em banho-maria, pois aumentos rápidos de temperatura podem comprometer a estabilidade do soro. Combinar 240 μl de gentamicina 50 mg/ml e 5 ml de penicilina/estreptomicina 100x num balão de cultura padrão e adicionar ao meio. Conservar o meio a 4°C.
- Semear células U937 a ~4 x 104 células/ml num balão de 25 cm2 utilizando o meio preparado. Avalie as células quanto à concentração e viabilidade usando um contador de células TC20 e exclusão de azul de tripano, colocando 15-20 μl de células e 15-20 μl de azul de tripano em um tubo de microcentrífuga e misturando o conteúdo. Pipetar 15-20 μl desta mistura para uma lâmina de amostragem TC20 e iniciar as contagens colocando a lâmina no contador de células TC20.
- Incubar células a 37 °C e 5% de CO2 e verificar a viabilidade celular usando a exclusão de azul de tripano e o contador de células TC20. Quando as células estiverem numa concentração adequada e/ou tiverem sido tratadas com sonossensibilizadores durante um período de tempo adequado, transferir 3 ml de células do balão de cultura para um frasco para injetáveis de cintilação de vidro de 20 ml. Neste protocolo, cultive células U937 por 48 horas e, em seguida, trate com 0,5, 1 ou 5 mM MeβCD por 30 min para esgotar suficientemente o colesterol das células antes da sonicação.
2. Sonicação celular
- Desgaseifica água desionizada e destilada usando vácuo e frasco de Buchner. Transfira a água para a buzina do copo e encha até um nível de 15 mm acima do topo da buzina. O processo de sonicação causa mais desgaseificação da água por um período de alguns minutos e pode levar a inconsistências ao longo do experimento se o sistema não for executado antes da sonicação da amostra. Portanto, execute o sistema por ~ 7 minutos antes da sonicação da amostra.
- Encaixe o frasco para injetáveis de cintilação contendo as células no dispositivo de retenção. Em seguida, fixe o dispositivo de fixação na parte superior da buzina do copo e ajuste a uma elevação de 15 mm da parte superior da buzina (na superfície da água usando o mecanismo deslizante).
- As células são tipicamente sonicadas usando três pulsos de ultrassom de 1 segundo, com espaçamento de 1 segundo entre cada um desses pulsos. Para este protocolo, sonicar as células na amplitude de 33% e 50% usando a dosagem de pulso acima mencionada.
3. Avaliação de células quanto a danos pós-sonicação
- Avalie as células suspensas quanto a danos e viabilidade usando azul de tripano e o contador de células TC20. Além disso, analise a amostra usando um contador Z2. Para a análise do contador Z2, pipetar uma suspensão celular de 100 μl para 20 ml de solução salina isotónica (proporção de 200:1). Antes da análise, lave a abertura do analisador de partículas Z2 pelo menos duas vezes usando solução salina isotônica. Coloque a amostra Z2 no suporte do contador e levante a plataforma até a abertura antes de iniciar as contagens.
- Adquira os dados dos contadores TC20 e Z2 usando o software fornecido pelo fabricante. Analise esses dados quanto a danos celulares, viabilidade e criação de detritos celulares a partir da sonicação.