Ensaio XTT: Um ensaio colorimétrico para avaliar a viabilidade celular e a atividade mitocondrial

Resumo

Trendowski, M., et al. Geração e Análise Quantitativa de Ultrassom Pulsado de Baixa Frequência para Determinar a Sensibilidade Sônica de Células Neoplásicas Não Tratadas e Tratadas. J. Vis. Exp. (2015)

Este artigo descreve o protocolo para o ensaio XTT, que é um ensaio colorimétrico para avaliar a viabilidade celular e a atividade mitocondrial.

Protocolo

1. Ensaio XTT para determinar a viabilidade celular e a atividade mitocondrial de células U937 e THP1 tratadas

1. Antes dos ensaios XTT, cultive células U937 e THP1 nas mesmas condições. Pré-trate as células com a mesma faixa de concentração de MeβCD por 30 minutos antes da sonicação. Use os mesmos parâmetros de ultrassom de antes, exceto que as células agora são sonicadas usando uma faixa de 1-3 pulsos de um segundo espaçados por um segundo para desenvolver uma faixa de danos para o kit XTT avaliar.
   nota: Muitas dessas etapas são retiradas diretamente do manual do kit XTT e são repetidas apenas para conveniência dos laboratórios interessados.
2. Colete as células por centrifugação a 200 x g por 10 min. Ressuspenda o pellet celular no meio de crescimento descrito anteriormente. Ressuspenda as células a ~ 1 x 10⁵ células / ml. Semeie células U937 a 100 μl por poço em uma placa de microtitulação de 96 poços de fundo plano em triplicata e, em seguida, repita para células THP1 usando uma placa separada de 96 poços. Incluir 3 alvéolos de controlo contendo 100 μl de meio de crescimento completo apenas como leituras de absorvância em branco. Em seguida, incube as placas inoculadas por 24 horas.
3. Descongelar duas alíquotas do reagente XTT e do reagente de activação a 37 °C antes da utilização. Gire as alíquotas suavemente até obter soluções claras. Adicione 0,1 ml do reagente de ativação a 5,0 ml do reagente XTT, que forma uma solução XTT ativada suficiente para um ensaio de placa de microtitulação de 96 poços. Repita o processo para a outra placa.
4. Adicionar 50 μl da solução de XTT ativada a cada alvéolo. Retorne a placa para a incubadora de CO₂ de cultura de células por 2 horas. Agite a placa suavemente após o período de incubação para distribuir uniformemente a cor laranja nos poços positivos. Meça a absorbância dos poços de ensaio contendo as células e os poços de controle de fundo em branco em um comprimento de onda entre 450-500 nm de comprimento de onda usando um leitor de placas de microtitulação.
5. Zerar o leitor de placas de microtitulação utilizando os alvéolos de controlo em branco ou subtrair o seu valor médio dos resultados específicos. Medir novamente a absorvância de todos os alvéolos de ensaio a um comprimento de onda compreendido entre 630-690 nm e subtrair os valores dos valores obtidos de 450-500 nm. Nota: Esta segunda determinação de absorbância ajuda a eliminar leituras não específicas dos resultados do ensaio. O ensaio XTT foi repetido quatro vezes para ambas as linhagens celulares.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio de Dulbecco Modificado de Iscove com NaHCO3 & Hepes de 25mM	Tecnologias da Vida	12440079
Disruptor de célula Branson SLPe 40kHz com Cuphorn de 3" (25 mm)	Ultrassom de Branson	101-063-726	sonicação dispositivo
Ponta Um 100 μl e 1.000 μl Pontas de Filtro	EUA Científico	1120-1840, 1126-7810
Micropipeta de 100 μl	Wheaton	851164
Micropipeta de 1000 μl	Wheaton	851168
Forma Scientific Câmara dupla água Incubadora encamisada	Forma Científica	3131
Kit de ensaio de proliferação de células XTT	ATCC	30-1011K
Leitor de microplacas de 96 poços	Cole-Palmer	EW-13055-54
U937 Células de Leucemia Monocítica Humana	ATCC	CRL1593.2
Células de leucemia monocítica humana THP1	ATCC	TIB-202