Ensaio de marcação de pulso de bromodeoxiuridina: uma técnica para medir a proliferação celular

Resumo

Fonte: Welschinger R. et al. Rastreamento temporal da progressão do ciclo celular usando citometria de fluxo sem a necessidade de sincronização. J. Vis. Exp. (2015)

O vídeo descreve o ensaio de marcação de pulso passo a passo de células de mamíferos com bromodeoxiuridina (BrdU) para medir a proliferação celular. A captação de BrdU permite o rastreamento temporal de células que estavam na fase de síntese em um ponto específico no tempo, sem exigir que as células sejam sincronizadas.

Protocolo

1. Soluções e reagentes

1. RPMI completo
   1. Adicione 56 ml de soro fetal de bezerro (FCS) e 5,5 ml de L-glutamina 200 mM a um frasco de 500 ml de meio RPMI-1640.
2. Solução de Estoque BrdU
   1. Prepare 32,5 mM de BrdU (10 mg / ml) em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS).
3. BrdU RPMI completo
   1. Adicionar 6,2 μl de solução-mãe de BrdU a 10 ml de RPMI completo.
4. Solução DNase
   1. Preparar 1 mg de DNase/ml em DPBS.
5. Tampão de coloração
   1. Prepare 3% de FCS inativado por calor e 0.09% de azida de sódio em DPBS.
6. Consulte a Lista de Materiais para obter as definições de Amortecedor de Fixação, Amortecedor de Permeabilização e Amortecedor de Lavagem.

2. Células

NOTA: As células não foram cultivadas por mais de 6 meses. Este método é diretamente adaptável a qualquer linhagem celular não aderente com ajustes na densidade celular e no meio de cultura. Use células que estão crescendo exponencialmente no início do experimento.

1. Manter as células NALM6 em frascos de cultura T-75 em RPMI completo. Execute todas as etapas em condições estéreis usando um Gabinete de Biossegurança Classe II.
2. Mantenha as células NALM6 entre 1-2 x 10⁶ células por ml, dividindo a cultura três vezes por semana.
3. Incubar a 37 °C em 5% de CO₂ no ar.

3. Marcação de pulso de células com BrdU

CUIDADO: Manuseie o BrdU com cuidado, pois é um potencial mutagênico e teratogênico.

1. Centrifugar células a 150 x g por 5 min.
   nota: A transferência de células para meios frescos melhora a reprodutibilidade dos resultados.
2. Realize uma contagem de células e ressuspenda as células em RPMI completo a 2 x 10⁶ células / ml.
3. Dilua as células 1 em 2 com BrdU RPMI completo, produzindo uma concentração celular final de 1 x 10,⁶ células/ml.
4. Incubar a 37 °C com 5% de CO₂ durante 45 min e, em seguida, diluir as células 1 em 10 com RPMI completo. Centrifugue as células a 150 x g por 5 min e descarte cuidadosamente todo o sobrenadante.
5. Ressuspenda as células em um pequeno volume (~ 100 μl) de RPMI completo, faça uma contagem de células e ajuste para 1 x 10⁶ células / ml.
6. Pipetar 1 ml de células para os alvéolos de uma placa de 48 poços. Pipetar 1 ml de DPBS em quaisquer poços desocupados para obter resultados mais reprodutíveis.
7. Incube a 37 °C em 5% de CO₂ no ar para os pontos de tempo desejados, aqui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 24 hr.
   nota: O período de tempo dependerá do que o projeto experimental pretende medir.
8. Transfira todas as células para tubos FACS usando uma pipeta. Enxágue o poço sequencialmente com volumes de 1 ml de PBS até um volume total final de 5 ml.
9. Centrifugue a 150 x g por 5 min e remova cuidadosamente todo o sobrenadante. As células estão prontas para a coloração, faça isso (seção 4) imediatamente.

4. Coloração celular

NOTA: Se for necessária a coloração superficial das células, realize-a antes da fixação, garantindo que as células sejam mantidas a 4 °C durante todo o processo.

1. Ressuspenda as células em 100 μl de tampão de coloração (para coloração de superfície opcional, adicione o volume recomendado de anticorpo aos antígenos de superfície e incube por 30 min a 4 ° C).
2. Adicionar 1 ml de tampão de coloração, centrifugar durante 5 min a 150 x g e rejeitar o sobrenadante.
   Nota: O anticorpo específico, a concentração, o tempo de incubação, etc., variam de acordo com os objetivos experimentais específicos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
NALM6	DSMZ	ACC-128
5-Bromo-2′-desoxiuridina	sigma	B5002-1G
RPMI 1.640 sem L-Gln 500 ml	Lonza	12-167F
DPBS	Lonza	17-512F
Soro fetal bovino	FisherBiotec	FBS-7100113
Incubadora de CO2	fichário	C 150
Tubos FACS BD Falcon 12 x 75 mm	BD Biociências	352008
Citômetro de fluxo BD LSR FORTESSA	BD Biociências	FORTESSA
centrifuga	Spantrão	GT-175R