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1. Soluções e reagentes
- RPMI completo
- Adicione 56 ml de soro fetal de bezerro (FCS) e 5,5 ml de L-glutamina 200 mM a um frasco de 500 ml de meio RPMI-1640.
- Solução DNase
- Preparar 1 mg de DNase/ml em DPBS.
- Tampão de coloração
- Prepare 3% de FCS inativado por calor e 0.09% de azida de sódio em DPBS.
- Consulte a Lista de Materiais para obter as definições de Amortecedor de Fixação, Amortecedor de Permeabilização e Amortecedor de Lavagem.
2. Coloração celular
NOTA: Se for necessária a coloração superficial das células, realize-a antes da fixação, garantindo que as células sejam mantidas a 4 °C durante todo o processo.
- Ressuspenda as células em 100 μl de tampão de coloração (para coloração de superfície opcional, adicione o volume recomendado de anticorpo aos antígenos de superfície e incube por 30 min a 4 ° C).
- Adicionar 1 ml de tampão de coloração, centrifugar durante 5 min a 150 x g e rejeitar o sobrenadante.
nota: O anticorpo específico, a concentração, o tempo de incubação, etc., variam de acordo com os objetivos experimentais específicos.
- Fixação e permeabilização
- Ressuspenda as células em 100 μl de tampão de fixação e incube por 15 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 1 ml de tampão de lavagem, centrifugar durante 5 min a 150 x g e rejeitar o sobrenadante.
- Ressuspenda as células em 100 μl de tampão de permeabilização e incube as células por 10 min no gelo.
- Adicionar 1 ml de tampão de lavagem, centrifugar durante 5 min a 150 x g e eliminar o sobrenadante.
- Ressuspenda as células em 100 μl de tampão de fixação por tubo e incube por 5 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 1 ml de tampão de lavagem, centrifugar durante 5 min a 150 x g e rejeitar o sobrenadante.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui, se necessário. As células fixas são estáveis por vários dias a 4 ° C se ressuspensas em tampão de coloração. Remova o tampão de coloração após a centrifugação antes de prosseguir.
- Tratamento DNase
- Ressuspenda as células em 100 μl de solução de DNase (30 μg de DNase/106 células) e incube as células durante 1 hora a 37 °C.
- Adicionar 1 ml de tampão de lavagem, centrifugar a 150 x g durante 5 min e rejeitar o sobrenadante.
- Coloração de anticorpos
NOTA: A coloração para marcadores intracelulares diferentes de BrdU pode ser realizada simultaneamente com a coloração BrdU.
- IMPORTANTE: Prepare controles de compensação que consistem em células não coradas e células marcadas com cada fluorocromo único. Idealmente, use os mesmos anticorpos para controles de compensação que os usados nos tubos experimentais. No entanto, se isso não for viável, substitua os anticorpos por antígenos altamente expressos conjugados ao mesmo fluorocromo.
- Ressuspenda as células em 50 μl de tampão de lavagem e adicione 1 μl/106 células de anticorpo BrdU.
NOTA: Anticorpos diretamente conjugados a outros antígenos intracelulares específicos também podem ser adicionados.
nota: Anticorpos para histona H3 fosforilada em Ser10 podem ser usados para discriminar entre células em G2 e M, histona H3 é fosforilada em Ser10 durante a mitose. Anticorpos para cdc2 fosforilados em Tyr15 podem ser usados para detectar células que se comprometeram com a mitose.
- Incube as células por 20 min em temperatura ambiente.
- Adicione 1 ml de tampão de lavagem, centrifugue as células a 150 x g por 5 min e descarte o sobrenadante.
- DNA de coloração para análise do ciclo celular
- Soltar o pellet e adicionar 20 μl da solução de 7-AAD (0,25 μg).
NOTA: É fundamental usar uma quantidade constante de 7-AAD/célula.
- Ressuspenda as células em 1 ml de tampão de coloração.