Co-cultura 2D de células leucêmicas com BMSCs: um método para obter subpopulações de células leucêmicas

Resumo

Fonte: Slone, W. L. et al. Modelagem de leucemia resistente à quimioterapia in vitro.

Este vídeo descreve a técnica de co-cultura 2D de longo prazo de células de leucemia com células estromais da medula óssea para estudar sua interação com o microambiente da medula óssea. O modelo de cocultura 2D utiliza as células de leucemia linfoblástica aguda e o estroma da medula óssea ou osteoblastos que influenciam o fenótipo das células tumorais. Este estudo apoiará a investigação dos mecanismos subjacentes à sobrevivência suportada pela medula óssea de células leucêmicas durante a exposição à quimioterapia.

Protocolo

1. Preparação Avançada

1. Cultura de células estromais da medula óssea (BMSC) e osteoblastos (OB).
   1. Mantenha BMSC ou OB a 37 ° C em 6% de CO₂ e cresça em placas de cultura de tecidos de 10 cm até que 90% de confluência seja alcançada.
   2. Tripsinize as células BMSC ou OB e divida 1:2 em novas placas de 10 cm. As células são cultivadas de acordo com esses padrões até que sejam necessárias para a co-cultura leucêmica.

2. Estabelecendo e mantendo a co-cultura

1. Adicione 5-20 x 10⁶ células leucêmicas em 10 ml de meio de cultura específico do tumor em uma placa BMSC ou OB confluente de 80% a 90%.
   NOTA: Nosso laboratório mantém co-culturas a 37 ° C em 5% O₂ para recapitular melhor o microambiente da medula óssea, que demonstrou variar de 1% a 7%. No entanto, manter coculturas nessa tensão de oxigênio não é crítico para o estabelecimento das três subpopulações leucêmicas e fica a critério do laboratório.
2. A cada 4 dias^, remova todos os meios, exceto 1 ml (incluindo células leucêmicas em suspensão) e substitua por 9 ml de meios de cultura leucêmicos frescos. Ao remover 9 ml de meio da placa, tome cuidado para não perturbar as células estromais da medula óssea (BMSC) ou a camada aderente aos osteoblastos (OB).
   1. Remova a mídia inclinando a placa para o lado e aspire a mídia no canto da placa. Além disso, ao adicionar mídia nova, certifique-se de adicionar gota a gota no canto da placa contra a parede lateral para garantir o mínimo de interrupção da camada aderente ao BMSC ou OB.
3. Após o^12º dia de co-cultura, enxaguar as células leucêmicas da camada de BMSC ou OB pipetando suavemente os meios de cultura da placa para cima e para baixo sobre a placa aproximadamente 5 a 10 vezes e, em seguida, coletar em tubo cônico de 15 ml. Semear novamente em uma nova placa BMSC ou OB confluente de 80% a 90%, conforme descrito na etapa 2.1.
   NOTA: O enxágue suave da cocultura, conforme descrito na etapa 2.3, removerá as células leucêmicas brilhantes suspensas e de fase sem interromper a monocamada de BMSC ou OB. Isso permite que apenas as células tumorais sejam transferidas para a próxima placa de co-cultura. Este ciclo de 12 dias pode ser repetido quantas vezes forem necessárias com base nas necessidades do usuário.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de cultura de células de 100 x 20 mm	Greiner Bio-One	Nº 664160
Tubos de centrífuga cônicos de 15 ml	Produtos médicos mundiais	41021037	Usado para coleta de células
Meios de Cultura
Meios de cultura de osteoblastos	PromoCell	C-27001	Para meios de osteoblastos humanos
Mídia RPMI 1640	Mediatech, Inc.	Telefone: 15-040	Para preparação de meios tumorais
Células aderentes
Osteoblastos Humanos	PromoCell	C-12720	Os osteoblastos humanos foram cultivados de acordo com as recomendações do fornecedor.
Células estromais de Morrow de osso humano	Núcleo de bioespécime WVU		Leucemia humana primária não identificada e células estromais da medula óssea (BMSC) foram fornecidas pelo Núcleo de Processamento de Bioespécimes do Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) e pelo Banco de Tecidos do Departamento de Patologia da Universidade de West Virginia
Células Leucêmicas
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	As células REH foram cultivadas de acordo com as recomendações do fornecedor e os meios recomendados.
SD-1	DSMZ	ACC 366	Os SD-1 foram cultivados de acordo com as recomendações do fornecedor e os meios recomendados.