Colheita de subpopulações leucêmicas: um método para separação espacial de subpopulações de células leucêmicas da co-cultura 2D

Abstract

Fonte: Slone, W. L., et al. Modelagem de leucemia resistente à quimioterapia in vitro.

Este vídeo descreve um método para separação espacial de três subpopulações de células leucêmicas: as células leucêmicas suspensas flutuando livremente no meio, células leucêmicas brilhantes de fase aderidas à superfície da monocamada de células estromais mesenquimais e as células leucêmicas de fase fraca que migraram sob a monocamada de células estromais mesenquimais da co-cultura 2D.

Protocol

1. Separando 3 subpopulações dentro da co-cultura

1. Coleção da subpopulação tumoral de suspensão (S).
   1. Aspirar os meios da placa de cocultura com uma pipeta e voltar a aplicar suavemente os mesmos meios para enxaguar a placa e recolher os meios contendo células leucémicas num tubo cónico de 15 ml. As células leucêmicas coletadas são a subpopulação S.
2. Coleção da subpopulação tumoral Phase Bright (PB).
   1. Adicione 10 ml de meio fresco de volta à placa de co-cultura. Enxágue vigorosamente pipetando o meio adicionado para cima e para baixo aproximadamente 5 vezes para remover as células leucêmicas aderentes, mas não com força suficiente para desalojar o componente BMSC / OB aderente.
   2. Aspirar com pipeta e recolher os meios num tubo cónico de 15 ml. As células coletadas são a subpopulação PB.
3. Coleção da subpopulação tumoral de Phase Dim (PD).
   1. Enxágue a placa com 1 ml de PBS para remover o meio restante. Tripsinizar a placa de co-cultura com 3 ml de tripsina e colocá-la em incubadora a 37 °C durante 5 min.
   2. Remova a placa da incubadora e bata suavemente nas laterais da placa para desalojar o BMSC/OB aderente.
   3. Adicione 1 ml de soro fetal bovino (FBS) e pipete para cima e para baixo 3-5 vezes para quebrar os agregados de células grandes.
   4. Colete os meios com células em um tubo cônico de 15 ml. Essas células também são a subpopulação de DP não purificada com BMSC / OB.
4. Centrifugar 3 subpopulações isoladas a 400 x g durante 7 min. Aspirar e rejeitar o sobrenadante e, em seguida, ressuspender individualmente os sedimentos em meio pré-aquecido de 1 ml. As células estão prontas para serem carregadas em uma coluna G10.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de centrífuga cônicos de 50 ml	Produtos médicos mundiais	41021039	Solução conservante para espécimes de citologia
Tubos de centrífuga cônicos de 15 ml	Novacyt	NA	Usado para coleta de células
Soro fetal bovino	sigma	F6178
0,05% de tripsina	Mediatech, Inc	5229 TEC 5	25-053-CI
Placas de cultura de células de 100 x 20 mm	Greiner Bio-One	Nº 664160
Mídia de cultura
Meios de cultura de osteoblastos	PromoCell	C-27001	Para meios de osteoblastos humanos
Mídia RPMI 1640	Mediatech, Inc.	Telefone: 15-040	Para preparação de meios tumorais
Linhas celulares
Osteoblastos Humanos	PromoCell	C-12720	Os osteoblastos humanos foram cultivados de acordo com as recomendações do fornecedor.
Células estromais de Morrow de osso humano	Núcleo de bioespécime WVU		Leucemia humana primária não identificada e células estromais da medula óssea (BMSC) foram fornecidas pelo Núcleo de Processamento de Bioespécimes do Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) e pelo Banco de Tecidos do Departamento de Patologia da Universidade de West Virginia. As culturas de BMSC foram estabelecidas conforme descrito anteriormente (*)
Células leucêmicas
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	As células REH foram cultivadas de acordo com as recomendações do fornecedor e os meios recomendados.
SD-1	DSMZ	ACC 366	Os SD-1 foram cultivados de acordo com as recomendações do fornecedor e os meios recomendados.