Classificação de células de leucemia baseada em coluna G-10: um método para purificar células de leucemia linfoblástica aguda de células estromais da medula óssea

Resumo

Fonte: Slone, W. L.,et al. Modelagem de Leucemia Resistente à Quimioterapia In Vitro. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo descreve a separação de células de leucemia linfoblástica aguda de células estromais da medula óssea usando colunas G-10 de dextrana reticulada tipo gel dez Este método ajuda a recuperar a população de células tumorais que migraram abaixo das células estromais da medula óssea aderentes, gerando uma população de células tumorais de "fase escura".

Protocolo

1. Carregando células de cocultura na coluna G10

NOTA: Certifique-se de que a torneira esteja completamente fechada antes de adicionar mídia contendo células à coluna G10. Além disso, cada subpopulação deve ser executada em uma coluna G10 separada para não introduzir nenhum viés entre as populações na análise a jusante.

1. Usando uma pipeta de 1.000 μl, adicione 1 ml de cada subpopulação de células em meio pré-aquecido a uma coluna G10 separada gota a gota. Certifique-se de que o meio que contém as células permaneça no topo ou dentro do pellet G10. Permita que as células incubem no pellet G10 por 20 min em RT.
   nota: A torneira permanece fechada durante a incubação.

2. Coletando células leucêmicas da coluna G10

1. Adicione 1-3 ml de mídia pré-aquecida a cada coluna G10. Abra a válvula de torneira e deixe a mídia sair lentamente da coluna em sentido de queda.
   nota: É crucial manter uma taxa de fluxo lenta da coluna ou o pellet G10 contendo BMSC/OB pode sair da coluna e contaminar as células leucêmicas isoladas.
2. Continue a adicionar mídia pré-aquecida em pequenos incrementos (1-2 ml) à coluna G10 até que um total de 15 a 20 ml tenha passado pela coluna e tenha sido coletado. Feche a válvula de parada e o tubo de coleta da tampa.
   nota: Se um pellet de partícula G10 for visto no fundo do tubo de coleta, remova cuidadosamente o meio do tubo deixando o pellet de partícula G10 intacto e transfira para um novo tubo.
3. Centrifugar os meios recolhidos a 400 x g durante 7 min à RT. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento da célula em tampão adequado para aplicação a jusante.
4. As células são agora uma população pura de células leucêmicas livres de contaminação por BMSC ou OB e estão prontas para serem aplicadas em aplicações a jusante a critério do usuário.
   NOTA: A viabilidade celular leucêmica deve permanecer inalterada ao passar células pelas colunas G10.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
G10 contas de sephadex	sigma	G10120	Referidas no manuscrito como partículas de dextrano reticuladas de gel tipo 10
Seringa estéril de 10 ml	Bd	309604
Torneiras de 1 via	Instrumentos de precisão mundiais, Inc.	14054-10
Osteoblastos Humanos	PromoCell	C-12720	Os osteoblastos humanos foram cultivados de acordo com as recomendações do fornecedor.
Células estromais de Morrow de osso humano	Núcleo de bioespécime WVU		Leucemia humana primária não identificada e células estromais da medula óssea (BMSC) foram fornecidas pelo Núcleo de Processamento de Bioespécimes do Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) e pelo Banco de Tecidos do Departamento de Patologia da Universidade de West Virginia. As culturas de BMSC foram estabelecidas conforme descrito anteriormente (*)
0,05% de tripsina	Mediatech, Inc.	25-053-CI
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	As células REH foram cultivadas de acordo com as recomendações do fornecedor e os meios recomendados
Lã de vidro	Pyrex	3950
Tubos de centrífuga cônicos de 50 ml	Produtos médicos mundiais	41021039	Usado como tubos de coleta
Tubos de centrífuga cônicos de 15 ml	Produtos médicos mundiais	41021037	Usado para coleta de células
Soro fetal bovino	sigma	F6178
SD-1	DSMZ	ACC 366	Os SD-1 foram cultivados de acordo com as recomendações do fornecedor e os meios recomendados
Placas de cultura de células de 100 x 20 mm	Greiner Bio-One	Nº 664160