Amostragem de sangue retro-orbital: um método para isolar células mononucleares do seio retro-orbital de um camundongo

Resumo

Fonte: Mopin A. et al. Um protocolo detalhado para caracterizar a linha celular murina C1498 e seu modelo de camundongo com leucemia associado. J. Vis. Exp. (2016)

O vídeo descreve um método de amostragem para coleta de sangue periférico do seio retroorbital de um camundongo e posterior isolamento de células mononucleares do sangue com centrifugação por gradiente de densidade.

Protocolo

1. Coleta de sangue retroorbital

1. Realize a coleta de sangue retroorbital imediatamente antes da eutanásia em condições estéreis em uma capela de fluxo laminar e sob uma lâmpada de aquecimento para evitar hipotermia.
2. Para anestesia, use cetamina a 150 mg/kg e xilazina a 10 mg/kg. Prepare a solução anestésica diluindo 1,5 ml de cetamina e 0,5 ml de xilazina em 18 ml de solução de PBS.
3. Insira um tubo capilar no canto medial do olho. O sangue subirá do seio orbital para o tubo capilar. Controle o sangramento aplicando pressão suavemente no olho com uma esponja de gaze estéril.
   nota: Um volume de 100 a 200 μl de sangue pode ser coletado usando esta técnica.
4. Colete o sangue em um tubo de EDTA e armazene a amostra no gelo antes de isolar as células mononucleares.

2. Isolamento de células mononucleares do sangue

1. Transfira a amostra de sangue (100 a 200 μl; obtida na etapa 1.1) para um tubo de microcentrífuga e adicione a solução de PBS / 1 mM EDTA até que o volume da solução seja de 500 μl. Coloque cuidadosamente 500 μl de solução de separação sob a solução contendo o sangue usando uma agulha 30G e uma seringa de 1 ml. Não misture o sangue e a solução de separação.
2. Centrifugue os tubos a 800 x g (sem freio) por 20 min em RT. Após centrifugação, recolher o anel celular (a camada branca opaca) com uma pipeta. Transfira as células para um tubo de microcentrífuga.
   nota: A camada branca opaca contém linfócitos e monócitos e aparece entre a camada inferior - a solução separadora - e a camada superior.
3. Adicionar 1 ml de solução de PBS e centrifugar o tubo a 350 x g durante 10 min. Ressuspender as células em 600 μl de tampão FACS.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cetamina 1000 (100 mg/ml)	VIRBAC	3.59713E+12
Xilazina SEDAXILANA (20 mg/ml)	CEVA
Solução PBS (1x concentrado)	ThermoFisher Scientific	14190
Solução ultrapura de EDTA 0,5 M, pH 8,0	ThermoFisher Scientific	Rolamento 15575
Solução de separação (Pancoll Mouse)	PANBIOTECH	Pág. 04-64100
Tubo de EDTA	Greiner Bio-One	454034
Pipeta Pasteur 150 mm (tubo capilar)	Marca de pescador	1154-6963
Tubos de citometria de fluxo (azul)	Beckman Coulter	2523749
Tubo de microcentrífuga (1,5 ml)	ThermoFisher Scientific	05-408-129
Esponjas de gaze estéreis	URGO	Rolamento 501580
Agulha de 30 G	Becton & Dickinson	Rolamento 304000
Seringa de 1 ml	Terumo	SS-01T
Citocentrífuga Shandon Cytospin 3	ThermoFisher Scientific