$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Caracterização in vitro da linha celular C1498
- Cultura in vitro de células C1498
- Prepare o meio RPMI completo (Roswell Park Memorial Institute) 1640 adicionando 50 ml de soro fetal bovino (FBS), 5 ml de penicilina (100 U / ml) -estreptomicina (100 μg / ml), 500 μl de 50 mM de β-mercaptoetanol, 5 ml de ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano sulfônico (HEPES), 5 ml de aminoácidos não essenciais e 5 mL de piruvato de sódio a 500 ml de meio RPMI.
- Cultive a linha celular C1498 em RPMI completo. Colher as células em suspensão por pipetagem e transferi-las para um tubo de 50 ml. Centrifugue a 350 x g durante 10 min e retire o sobrenadante.
- Adicionar 20 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) (1x), centrifugar a 350 x g durante 10 min e remover o sobrenadante.
- Ressuspenda as células em 10 ml de tampão Classificador de Células Ativadas por Fluorescência (FACs) (2,5 g de pó de albumina de soro bovino (BSA) e 2 ml de solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,5 M em 500 ml de solução de PBS). Conte as células usando uma câmara de contagem de células Thoma depois de corar as células com azul de tripano.
2. Preparação de uma suspensão celular em lâminas para microscopia
- Lavar duas vezes 106 células C1498 colhidas (obtidas no passo 1.1.4) com 5 ml de tampão FAC frio e diluir as células em 1 ml de tampão FAC frio. Coloque os tubos no gelo.
- Coloque as lâminas em câmaras descartáveis com cartões de filtro pré-fixados e coloque-os em uma citocentrífuga.
- Adicione 100 μl de tampão FACs a cada câmara e cartão de filtro e gire-os por 2 min a 4,52 x g.
- Adicione 100 μl de células a cada câmara e cartão de filtro e gire as células a 4,52 x g por 2 min.
- Remova cuidadosamente as lâminas das câmaras e seque-as ao ar antes de corá-las com a coloração May-Grünwald Giemsa.
3. Coloração de May-Grünwald Giemsa (MGG)
- Manchar as células (preparadas na secção 2) imergindo as lâminas num frasco de Coplin contendo a solução de May-Grünwald durante 3 min.
- Transfira as lâminas para um frasco Coplin contendo a solução tampão de pH 6,8 por 1 min.
- Pinte as lâminas colocando-as em um frasco Coplin contendo a solução Giemsa R (diluída a 1/20 em solução tampão de pH 6,8) por 10 min. Lave as lâminas com água neutra (pH 7) por 10 segundos.
- Escorra e seque as lâminas ao ar. Monte as lâminas aplicando uma gota do meio de montagem 2 nas células. Coloque uma borda da lamínula na lâmina e abaixe-a cuidadosamente sobre as células usando uma pinça. Pressione suavemente a lamínula para remover quaisquer bolhas de ar.