Centrifugação por gradiente de densidade: um método para isolar células LLC do sangue periférico

Abstract

Fonte: Hay, J. et al. Fracionamento subcelular de células de leucemia linfocítica crônica primária para monitorar o tráfego de proteínas nucleares/citoplasmáticas. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo descreve a técnica de isolamento de células de leucemia linfocítica crônica (LLC) do sangue periférico. Com este protocolo, isolaremos as células da LLC da amostra de sangue do paciente humano para posterior geração eficiente de frações nucleares e citoplasmáticas.

Protocol

1. Isolamento de células LLC de amostras de sangue de pacientes

1. Amostras de sangue periférico de pacientes com LLC previamente consentidas são recebidas da clínica em tubos de coleta de sangue EDTA, acompanhadas pela contagem de glóbulos brancos (WCC). Purifique as amostras de LLC do sangue periférico de acordo com o WCC. Para WCC < 40 x 10⁶ células/mL, prossiga para a etapa 1.1.1; para WCC ≥ 40 x 10⁶ células/mL, prossiga para a etapa 1.1.2.
   1. Despeje o conteúdo de todos os tubos de sangue EDTA em um tubo de centrífuga cônico de 50 mL e adicione 50 μL de coquetel de enriquecimento de células B humanas por 1 mL de sangue. Incubar à temperatura ambiente (RT) durante 20 min. Prossiga para a etapa 1.1.2.
   2. Dilua a amostra na proporção de 1:1 com tampão de lavagem RT CLL (solução salina tamponada com fosfato (PBS), soro fetal bovino (FBS) a 0,5% e EDTA 2 mM).
2. Alíquota RT gradiente de densidade em um tubo de centrífuga cônico de tamanho apropriado para a amostra (10 mL em um tubo de 50 mL para 30 mL de amostra ou 4 mL em um tubo de 15 mL para 10 mL de amostra).
3. Coloque cuidadosamente a amostra em camadas sobre o meio de gradiente de densidade e centrifugue a 400 x g por 30 min em RT.
   NOTA: Certifique-se de que a centrífuga esteja em RT antes que as amostras sejam colocadas na centrífuga, pois uma mudança de temperatura resultará em um enriquecimento deficiente das células mononucleares e desligue o freio da centrífuga, pois a frenagem repentina pode interromper a interface do líquido.
4. Colha suavemente a camada branca de células mononucleares que se acumulam na interface do meio de gradiente de densidade e do tampão de lavagem CLL, em um tubo de centrífuga cônico fresco de 50 mL usando uma pipeta de plástico Pasteur.
5. Adicione 40 mL de tampão de lavagem CLL à monocamada isolada para lavar as células e centrifugue a 300 x g por 10 min em RT.
6. Rejeitar o sobrenadante, ressuspender o sedimento sacudindo o fundo do tubo e, em seguida, repetir o passo de lavagem descrito no passo 1.5.
7. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet conforme descrito na etapa 1.6 e, em seguida, ressuspenda o pellet em um volume definido de tampão de lavagem CLL (até 40 mL, dependendo do tamanho do pellet da célula).
8. Contar as células com azul de tripano e um hemocitómetro. Em seguida, prossiga para a citometria de fluxo para verificar a pureza das células da LLC.
   NOTA: Nesta fase, as células LLC podem ser cultivadas a uma concentração de 10 x 10⁶ células/mL em meios para serem usados em experimentos e/ou criopreservadas em dimetilsulfóxido (DMSO)/FBS a 10% para trabalhos futuros em concentrações de até 100 x 10⁶ células/frasco.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de 15 mL	Griener Bio um	188271
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	Griener Bio um	616201
Dmso	sigma	D2650
Edta	sigma	Eds
Soro fetal bovino	Thermofisher	10500064
Histopaque1077 mídia gradiente de densidade	sigma	H8889
Solução Trypan Blue	Thermofisher	15250061
Tablets PBS	Fisher Científico	BR0014G
RosetteSep Coquetel de enriquecimento de células B humanas	Tecnologias de células-tronco	Rolamento 15064
Sigma 3-16P	SciQuip		centrifuga