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1. Preparação de Frações Subcelulares a partir de Células LLC
NOTA: Ao planejar a configuração experimental, inclua um poço de células não estimuladas/não tratadas a partir das quais o extrato celular inteiro possa ser gerado.
- Realize a estimulação desejada e/ou tratamento medicamentoso da linha celular MEC1 CLL ou células LLC primárias isoladas usando 10 – 20 x 106 células/condição. As células serão então usadas para fracionamento subcelular ou para gerar extrato de células inteiras, conforme explicado abaixo:
- Preparação de soluções/tubos: Preparar todas as soluções/tampões de forma fresca no dia do fracionamento, antes da colheita das células. Conservar as soluções no gelo até serem necessárias e utilizar nas 4 h seguintes à preparação.
- Solução de inibidor de PBS/fosfatase: Prepare os inibidores de fosfatase em PBS diluindo os inibidores de fosfatase 1:20 em 1x PBS (ou seja, 0,5 mL de inibidores de fosfatase em 9,5 mL de 1x PBS).
nota: Certifique-se de que os inibidores da fosfatase não precipitaram. Se houver precipitado, aquecer a 50 °C durante 10 min.
- Tampão hipotônico: Prepare 1x tampão hipotônico fazendo uma diluição de 1:10 de tampão hipotônico 10x em água destilada (ou seja, 50 μL de tampão hipotônico 10x em 450 μ L de dH2O).
- Ditiotreitol 10 mM (DTT): Prepare 10 mM DTT fazendo uma diluição de 1:100 de 1M DTT com água destilada (ou seja, 10 μL de 1 M DTT em 990 μL de dH2O).
nota: A TDT é altamente lábil, então prepare-a sempre com calma. Evite ciclos repetidos de congelamento/descongelamento.
- Buffer de lise completo: Determine quanto buffer é necessário para cada experimento. Cada amostra requer 50 μL de tampão de lise completo, portanto, adicione 5 μL de 10 mM DTT a 44,5 μL de tampão de lise e, em seguida, adicione 0,5 μL de coquetel inibidor de protease. Essa quantidade pode ser ampliada dependendo do número de amostras no experimento.
- Rotule quatro conjuntos de tubos de microcentrífugas de 1,5 mL para cada estimulação e/ou tratamento medicamentoso para as células recém-estimuladas, as frações citoplasmáticas recém-geradas, as frações nucleares recém-geradas e os lisados celulares inteiros. Pré-resfrie esses tubos de microcentrífugas no gelo até que seja necessário.
- Transfira as células para tubos de microcentrífugas de 1,5 mL rotulados individualmente e pellet centrifugando a 200 x g por 5 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL de inibidores de PBS / fosfatase gelados. Pulverizar as células por centrifugação a 200 x g durante 5 min a 4 °C. Retirar o sobrenadante e manter os sedimentos de células no gelo.
- Preparação de frações citoplasmáticas: Ressuspender suavemente os grânulos celulares a serem utilizados para fracionamento subcelular em 50 μL de tampão hipotônico 1x. Incube as células no gelo por 15 min para permitir que as células inchem.
nota: O volume de tampão hipotônico usado pode ser aumentado empiricamente, dependendo do número de células.
- Adicione 0,8 - 2,5 μL (1:20 a 1:60) de detergente em cada amostra e votice na configuração mais alta por 10 s.
- Para determinar a concentração ideal de detergente a ser usada para um tipo específico de célula para isolar frações nucleares e citoplasmáticas, execute um gradiente de detergente inicialmente. Um intervalo de 1:20 a 1:60 (ou seja, 2,5 μL a 0,8 μL de detergente em 50 μL de tampão hipotônico) deve ser adequado.
nota: Se o volume do tampão hipotônico na etapa 3.4 for ajustado, certifique-se de que a proporção de detergente apropriada seja mantida.
- Verifique a lise celular observando as células usando um microscópio de contraste de fase antes e depois da adição de detergente. As células inteiras parecem maiores com um núcleo denso e escuro. O citoplasma aparecerá como um halo brilhante ao redor do núcleo.
nota: A lise apropriada é confirmada usando Western blotting para analisar proteínas específicas dentro das frações lisadas geradas a partir do gradiente detergente.
- Uma vez lisadas, centrifugue as amostras a 14.000 x g por 30 s a 4 °C.
- Transfira cuidadosamente o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga pré-resfriado e rotulado. Esta fração citoplasmática pode ser armazenada a -80 °C até que seja necessária para análise posterior. O chumbinho restante contém a fração nuclear.
nota: Evite ciclos repetidos de congelamento/descongelamento das amostras.
- Preparação de frações nucleares: Ressuspender cada pellet nuclear em 50 μL de tampão de lise completo pipetando para cima e para baixo.
NOTA: O volume do tampão de lise completo pode ser ajustado empiricamente de acordo com o número da célula inicial.
- Adicione 2,5 μL de detergente para solubilizar proteínas associadas à membrana nuclear e ao vórtice na configuração mais alta por 10 s. Incube as amostras em gelo por 30 min.
- Agite na configuração mais alta por 30 s e, em seguida, centrifugue as amostras a 14.000 x g por 20 min a 4 ° C.
- Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga pré-resfriado e rotulado. Essa fração nuclear pode ser armazenada a -80 °C até que seja necessária para análise posterior.
nota: Evite ciclos repetidos de congelamento/descongelamento das amostras.