1. Preparação de reagentes
- Prepare 500 mL de PBS dissolvendo 137 mM de NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4, em ddH2O. Ajuste o pH para 7,4 com HCl. Esterilize em autoclavagem.
- Preparar 100 ml de meio RPMI: meio RPMI-1640 com L-alanil-glutamina suplementada com 10 % de soro fetal bovino (FBS), penicilina (100 U/ml) e estreptomicina (100 μg/ml).
- Prepare 50 mL de NaHCO3 0,1 M em água destilada. Ajustar o pH para 8,1, filtrar a esterilização (0,22 μm) e conservar a 4 °C.
nota: Para duas placas analisadoras de fluxo extracelular de 8 poços, prepare 250 μL de NaHCO3 0,1 M pH 8,1.
- Prepare 1 mL de D-glicose 2 M em água destilada. Esterilize por filtro (0,22 μm) e armazene a -20 °C.
- Preparar 100 μL de oligomicina A a 1 mM em etanol. Esterilize por filtro (0,22 μm) e armazene a -20 °C.
- Prepare 250 μL de 1 M 2-desoxi-D-glicose (2-DG) em DMEM mínimo (meio de Eagle modificado de Dulbecco). Aquecer a 37 °C e ajustar o pH a 7,4 (efectuar a medição do pH a 37 °C). Esterilize por filtro (0,22 μm) e armazene a -20 °C.
- Preparar 100 μL de FCCP 1 mM (cianeto de carbonila-p-trifluorometoxifenilhidrazona) em DMSO. Esterilize por filtro (0,22 μm) e armazene a -20 °C.
- Preparar 100 μL de rotenona a 1 mM em etanol. Esterilize por filtro (0,22 μm) e armazene a -20 °C.
- Preparar 100 μL de 1 mg/ml de antimicina A em etanol. Esterilize por filtro (0,22 μm) e armazene a -20 °C.
- Imediatamente antes do uso, prepare 10 mL de meio de teste de estresse de glicólise. Aqueça o DMEM mínimo a 37 °C em banho-maria e ajuste o pH para 7,4 (faça a medição do pH a 37 °C).
- Antes do uso, prepare 10 mL de meio de teste de estresse Cell Mito com BSA. Suplemente o DMEM mínimo com 2 mM de L-glutamina, 10 mM de D-glicose, 1 mM de HEPES (pH 7,4), 1 mM de piruvato e 0,1% de BSA (albumina de soro bovino). Aquecer a 37 °C em banho-maria e ajustar o pH a 7,4 (efectuar a medição do pH a 37 °C).
- Antes do uso, prepare 10 mL de meio de teste de estresse Cell Mito sem BSA. Suplemente o DMEM mínimo com 2 mM de L-glutamina, 10 mM de D-glicose, 1 mM de HEPES (pH 7,4) e 1 mM de piruvato. Meio de teste de estresse Warm Cell Mito sem BSA a 37 °C em banho-maria e ajuste o pH para 7,4 (realize a medição do pH a 37 °C).
NOTA: O BSA é adicionado ao meio de teste de estresse Cell Mito porque as células respondem melhor ao FCCP quando o meio é suplementado com BSA (diferentes condições foram testadas). O meio de teste de estresse Cell Mito sem BSA é usado para carregar as portas, pois o fabricante não recomenda o uso de BSA no meio.
2. Cultivo noturno de células mononucleares
NOTA: Execute todas as subetapas em uma capa de cultura de tecidos estéreis.
- Preparar dois balões T75 com 20 ml de RPMI. Adicionar 30 x 106 células mononucleares isoladas a cada balão. Incubar as células com o balão em repouso durante 16–24 h a 5% de CO2 e 37 °C.
3. Preparação de placas revestidas com adesivo celular
- Cubra duas placas de analisador de fluxo extracelular de 8 poços.
nota: Execute o revestimento em uma capa de cultura de tecidos estéril.
- Adicione 2,2 μL de adesivo celular (densidade: 2,54 mg / ml) a 250 μL de NaHCO3 0,1 M, pH 8,1, e pipete imediatamente 12,5 μL da solução em cada poço.
nota: As soluções de estoque de adesivo celular podem diferir em sua densidade, ajuste o volume adicionado ao NaHCO3 de acordo.
- Deixe as placas descansarem no exaustor por cerca de 20 min, depois aspire o adesivo celular e lave cada poço duas vezes com 200 μL de água estéril. Deixe descansar no capô com a tampa aberta até que os poços estejam secos.
- Use as placas imediatamente ou guarde até 1 semana a 4 °C com a borda envolvida em filme de parafina para evitar condensação. Certifique-se de que as placas estejam aquecidas até a temperatura ambiente (por cerca de 20 min) no exaustor antes de semear as células.
4. Hidratação do cartucho do sensor
NOTA: Hidrate dois cartuchos de analisador de fluxo extracelular de 8 poços.
- Separe a placa de utilidade e o cartucho do sensor. Coloque o cartucho do sensor de cabeça para baixo na bancada do laboratório.
- Encha cada poço da placa de utilidade com 200 μL de calibrante. Encha cada fosso ao redor da parte externa dos poços com 400 μL de calibrante.
- Retorne o cartucho do sensor para a placa de utilidade que agora contém o calibrante.
- Coloque o conjunto do cartucho em uma incubadora umidificada, sem CO2, 37 °C durante a noite.
- Ligue o analisador de fluxo extracelular e deixe-o aquecer a 37 °C durante a noite.
5. Semeando células em placas revestidas com adesivo celular
NOTA: Para teste de estresse de glicólise, use meio de teste de estresse de glicólise. Para o teste de estresse Cell Mito, use o meio de teste de estresse Cell Mito com BSA.
- Células-semente para o teste de estresse de glicólise e o teste de estresse Cell Mito em placas separadas. Para cada teste, use células de um frasco com cultura durante a noite.
- Centrifugue as células a 200 x g por 5 min à temperatura ambiente. Ressuspenda as células em 1 mL do meio apropriado e conte-as.
- Adicionar 4 x 106 de células vivas ao volume final de 400 μL (utilizar o meio adequado).
- Placa de 50 μL da suspensão celular nos poços BG. Certifique-se de que 500.000 células sejam semeadas em um poço.
nota: É crucial semear exatamente 500.000 células por poço, pois nenhuma outra normalização é realizada. Dessa forma, os resultados de diferentes pacientes podem ser comparados. O número ideal de réplicas é seis, conforme descrito aqui. O uso de menos réplicas não é recomendado, pois as células primárias às vezes podem se comportar de maneira errônea.
- Adicione 180 μL do meio apropriado nos poços A e H (esses poços servirão como uma correção de fundo).
- Centrifugue a placa a 400 x g durante 5 min à temperatura ambiente com o travão regulado para 1.
- Adicione 130 μL de meio apropriado aos poços B-G em duas placas analisadoras de fluxo extracelular de 8 poços lenta e cuidadosamente. Confirme visualmente se as células estão aderidas de forma estável ao fundo dos poços, visualizando ao microscópio.
- Coloque a placa em uma incubadora umidificada, sem CO2, 37 °C por 30 min.
6. Carregando o cartucho do sensor
- Para o teste de estresse de glicólise, prepare 250 μL de glicose 100 mM, 20 μM de oligomicina A e 1 M 2-DG, todos em meio de teste de estresse de glicólise.
- Para o teste de estresse Cell Mito, prepare 250 μL de 20 μM de oligomicina A, 15 μM FCCP, 30 μM FCCP e uma mistura de 10 μM de rotenona e 10 μg/ml de antimicina A, todos em meio de teste de estresse Cell Mito sem BSA.
nota: Recomenda-se a injeção de duas concentrações de FCCP em um ensaio, pois não há material suficiente para a titulação do FCCP. No entanto, as concentrações devem ser determinadas pelo pesquisador.
- Carregue os compostos nas portas injetoras apropriadas do cartucho da seguinte forma (Tabela 1):
7. Configurando o programa
- Para o teste de estresse de glicólise, configure o programa conforme descrito na Tabela 2.
- Para o teste de estresse Cell Mito, configure o programa conforme descrito na Tabela 3.
- Inicie o programa. Substitua a placa calibrante pela placa de ensaio (quando solicitado).
| porta | Teste de estresse de glicólise | Teste de estresse mito celular |
| Carregar no porto | Concentração final nos poços | Carregar no porto | Concentração final nos poços |
| um | 20 μL de glicose 100 mM | 10 mM de glicose | 20 μL de 20 μM de oligomicina A | 2 μM de oligomicina A |
| O | 22 μL de 20 μM de oligomicina A | 2 μM de oligomicina A | 22 μL de FCCP de 15 μM | FCCP de 1,5 μM |
| O | 25 μL de 1 M 2-DG | 100 mM 2-DG | 25 μL de FCCP de 30 μM | FCCP de 4,5 μM |
| D | X | | 25 μL de 10 μM de rotenona e 10 μg/ml de antimicina A | 1 μM de rotenona e 1 μg/ml de antimicina A |
Tabela 1: Volumes compostos.
| passo | Configurações |
| calibração | Automático |
| Equilibration | Automático |
| Medição de linha de base | Três vezes: Misturar – 3 min, Esperar – 0 min, Medir – 3 min |
| Injeção da porta A | injecção |
| medição | Três vezes: Misturar – 3 min, Esperar – 0 min, Medir – 3 min |
| Injeção da porta B | injecção |
| medição | Três vezes: Misturar – 3 min, Esperar – 0 min, Medir – 3 min |
| Injeção da porta C | injecção |
| medição | Quatro vezes: Misturar – 3 min, Esperar – 0 min, Medir – 3 min |
Tabela 2: Programa para teste de estresse de glicólise.
| passo | Configurações |
| calibração | Automático |
| Equilibration | Automático |
| Medição de linha de base | Três vezes: Misturar – 3 min, Esperar – 0 min, Medir – 3 min |
| Injeção da porta A | injecção |
| medição | Três vezes: Misturar – 3 min, Esperar – 0 min, Medir – 3 min |
| Injeção da porta B | injecção |
| medição | Três vezes: Misturar – 3 min, Esperar – 0 min, Medir – 3 min |
| Injeção da porta C | injecção |
| medição | Três vezes: Misturar – 3 min, Esperar – 0 min, Medir – 3 min |
| Injeção da porta D | injecção |
| medição | Três vezes: Misturar – 3 min, Esperar – 0 min, Medir – 3 min |
Tabela 3: Programa para teste de estresse Cell Mito.
