Colheita de medula óssea do membro posterior do camundongo

Resumo

Fonte: Zhu, Y. P., Padgett, et al. Preparação de Medula Óssea Inteira para Análise de Citometria de Massa de Células de Linhagem de Neutrófilos. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo descreve um protocolo detalhado para isolar a medula óssea inteira fresca dos membros posteriores do camundongo para investigar defeitos de MO total para pacientes com doenças do sangue, como leucemia.

Protocolo

1. Colher medula óssea de camundongo (BM)

1. Compre mouses C57BL/6J de um fornecedor comercial. Alimente a dieta padrão de ração para roedores e aloje em gaiolas de microisoladores em uma instalação livre de patógenos.
2. Use camundongos machos, de 6 a 10 semanas de idade, para fins experimentais. Eutanásia por inalação de CO₂ seguida da luxação cervical.
3. Coloque o mouse em uma almofada cirúrgica estéril com o abdômen voltado para cima. Esterilize a pele da área do abdômen e dos membros posteriores pulverizando etanol a 70%. Use uma tesoura cirúrgica de dissecação para abrir a cavidade abdominal.
4. Remova a pele para expor os membros posteriores. Use uma pinça de curativo de ponta romba para segurar a tíbia do camundongo logo abaixo do tornozelo. Use outro par de pinças de curativo curvas para estabilizar a tíbia abaixo da pinça de curativo de ponta romba. Quebre a tíbia e exponha o osso arrancando o músculo com a pinça de curativo de ponta romba.
   nota: A tíbia está frouxamente presa à articulação do joelho e pode ser facilmente identificada usando a pinça de curativo de ponta romba.
5. Coloque a tíbia em PBS frio 1x.
6. Em seguida, mova a pinça de curativo curva estabilizadora para baixo até o fêmur. Deslize a pinça de curativo de ponta romba abaixo da articulação do joelho e segure a rótula. Deslocar a rótula puxando-a suavemente para cima. Exponha o fêmur arrancando o músculo preso à rótula. Segure o fêmur exposto pela pinça de curativo curvo e corte o fêmur da parte inferior do osso usando uma tesoura cirúrgica de dissecação.
7. Coloque o fêmur em PBS frio 1x.
8. Faça um furo no tubo de microcentrífuga de 0,5 mL com uma agulha de 18 G.
9. Coloque a tíbia e o fêmur no mesmo tubo de microcentrífuga de 0,5 mL com a extremidade aberta dos ossos voltada para baixo em direção ao orifício.
10. Coloque o tubo de 0,5 mL contendo a tíbia e o fêmur em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
11. Girar os tubos de dupla camada contendo tíbia e fêmur a 5.510 x g por 30 s na microcentrífuga.
12. Certifique-se de que o BM seja extraído dos ossos e peletizado no fundo do tubo. Jogue o tubo de 0,5 mL contendo os ossos sagrados. O mouse BM está pronto para as próximas etapas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Rato: C57BL/6J	O Laboratório Jackson	Nº de estoque: 000664
Solução salina tamponada com fosfato HyClone	GE Lifesciences	Gato#SH30256.01