Enriquecimento de células T: uma técnica para isolar células T da população de células mistas por separação magnética

Resumo

Fonte: Nguyen, H. D., et al. Plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas na doença do enxerto contra o hospedeiro. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo descreve o enriquecimento de células T do baço de um camundongo por seleção negativa usando um separador magnético. A técnica envolve direcionar as outras células da amostra para depleção usando anticorpos ou ligantes direcionados contra antígenos específicos da superfície celular.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Dia 1: Prepare células T dos camundongos doadores

1. Use camundongos CD45.2 ⁺ H2k^{b +} C57BL / 6 tipo selvagem (WT) como doadores de células T.
2. Eutanasiar camundongos C57BL/6 por asfixia com dióxido de carbono (CO₂) e esperar 2−3 min até que estejam inconscientes. Realize a luxação cervical como uma eutanásia secundária, se necessário.
3. Limpe bem o pelo e a pele do camundongo com etanol a 70%. Extirpar os baços e os gânglios linfáticos e separá-los numa única suspensão celular de esplenócitos utilizando um êmbolo de seringa e filtros de malha de 40 μm. Lave o filtro e o êmbolo da seringa com 1% de RPMI (1% de FBS contendo meio RPMI) para coletar todos os esplenócitos.
4. Centrifugar a suspensão celular a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Adicionar 5 ml de tampão de lise ACK (1 mM Na₂EDTA, 10 mM KHCO₃, 144 mM NH₄Cl, pH 7,2) depois de eliminar o sobrenadante. Incubar a suspensão celular por 5 min em temperatura ambiente.
   nota: O tampão de lise ACK é usado para lisar glóbulos vermelhos.
5. Adicione 5 mL de 1% de RPMI para interromper a lise. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante.
6. Prepare tampão de classificação de células ativadas por magnetismo (MACS) gelado (0,5% BSA, 2 mM EDTA em PBS, pH 7,2). Desgaseifique o tampão antes de usar. Ressuspenda os grânulos celulares em 5 mL de tampão MACS.
7. Conte os esplenócitos e verifique as células vivas e mortas usando um hemocitômetro e azul de tripano a 1%. Guarde uma alíquota de 2 x 10⁶ células para avaliar o rendimento da purificação com análise por citometria de fluxo.
8. Ressuspenda os esplenócitos na concentração de 200 x 10⁶ / mL em tampão MACS. Adicione 0,03 μL de biotina anti-mouse-Ter-119, 0,03 μL de biotina anti-mouse-CD11b, 0,03 μL de biotina anti-mouse-CD45R e 0,03 μL de biotina anti-mouse-DX5 por 10⁶ células. Incubar por 15 min a 4 °C.
   nota: Biotina anti-mouse-Ter-119, biotina anti-mouse-CD11b, biotina anti-mouse-CD45R e biotina anti-mouse-DX5 foram usadas para reagir com células eritróides, granulócitos, células B e NK, respectivamente. Portanto, esses subconjuntos de células são esgotados na etapa seguinte.
9. Adicione 10 mL de tampão MACS gelado à suspensão celular. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante.
10. Ressuspenda os grânulos celulares no tampão MACS a uma concentração de 100 x 10⁶ / mL. Adicione microesferas anti-biotina (0,22 μL / 10⁶ células) à suspensão de esplenócitos. Misture bem e incube por mais 15 min a 4 ° C. Lave a suspensão celular uma vez com 10 mL de tampão MACS gelado. Centrifugue a 800 x g durante 5 min a 4 °C e elimine o sobrenadante.
11. Coloque uma coluna de separação magnética no campo magnético. Enxágue a coluna com 3 mL de tampão MACS. Solte a suspensão da célula na coluna. Colete o fluxo que consiste em células T enriquecidas e não ligadas, em um novo tubo cônico de 15 mL. Lave a coluna MS com 3 mL de tampão MACS gelado.
    nota: Certifique-se de que a coluna esteja vazia antes de executar as etapas de lavagem.
12. Centrifugue a suspensão celular a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Ressuspenda o sedimento celular em 5 ml de tampão MACS.
13. Conte as células em azul de tripano a 1% usando um hemocitômetro. Guarde uma alíquota de 2 x 10⁶ células para uma verificação de pureza por citometria de fluxo.
    nota: O rendimento médio de células T esplênicas isoladas por este método é de ~ 20−25 x 10⁶ células por camundongo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RPMI 1640	Thermo Fisher Scienctific	11875-093	mídia
MidiMACS	Miltenyi Biotec	130-042-302	Enriquecimento de células T
0,5 M EDTA pH 8,0 100ML	Fisher Científico	BP2482100	Buffer MACS
10X PBS	Fisher Científico	BP3994	Buffer MACS
Microesferas anti-biotina	Miltenyi Biotec	130-090-485	Enriquecimento de células T
Anti-Humano/Rato CD45R (B220)	Thermo Fisher Científico	13-0452-85	Enriquecimento de células T
Biotina CD4 Anti-Mouse	Thermo Fisher Científico	13-0041-86	Enriquecimento de células T
CD11b	Thermo Fisher Científico	13-0112-85	Enriquecimento de células T
CD25-biotina	Thermo Fisher Científico	13-0251-82	Enriquecimento de células T
CD45R	Thermo Fisher Científico	13-0452-82	Enriquecimento de células T
Anticorpo monoclonal CD49b (DX5)-biotina	Thermo Fisher Científico	13-5971-82	Enriquecimento de células T
Biotina anti-rato TER-119	Thermo Fisher Científico	13-5921-85	Enriquecimento de células T
Anti-mouse CD45.1 PE	Thermo Fisher Científico	12-0900-83	Análise de citometria de fluxo
Camundongos C57BL/6	Rio Charles	27	Doadores/Receptores
Tubos de citometria de fluxo	Fisher Científico	352008	Análise de citometria de fluxo
Filtro de células 40 uM	Thermo Fisher Científico	22363547	Preparação celular