Geração de células dendríticas derivadas da medula óssea: um método para gerar células dendríticas a partir da medula óssea de camundongos

1. Gerar células dendríticas derivadas da medula óssea (BM-DCs).

1. Isole a medula óssea dos fêmures e tíbias de camundongos WT ou fator B (fB) ^-/- no fundo B6. Resumidamente, colete a tíbia e o fêmur de ambas as pernas usando uma pinça e uma tesoura. Coloque-os em RPMI gelada contendo 1% de FCS e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina e 2 mM de L-glutamina (1% de RPMI) em tubos cônicos de 50 mL. Limpe bem o fêmur e os ossos da tíbia, removendo todos os tecidos musculares usando uma pinça e uma tesoura. Transferir o fémur e a tíbia dos tubos cónicos de 50 ml para uma placa de Petri de 92 mm de diâmetro contendo 1% de RPMI. Usando uma tesoura, corte as pontas do fêmur ou da tíbia. Encha um tubo de 50 mL com 25 mL de meio RPMI 1640 a 1%. Use-o para encher uma seringa de 3 mL conectada a uma agulha de 26 G com 3 mL de RPMI a 1%. Insira esta seringa no osso e empurre o êmbolo para liberar a medula óssea (MO) para fora da cavidade para o tubo de coleta com 1% RPMI (~ 3 mL / osso). Gire as células a 800 x g por 5 min.
2. Ressuspenda o pellet em 5 mL de tampão de lise ACK para lise de glóbulos vermelhos. Incubar a suspensão celular por 5 min no gelo. Adicione 10 ml de RPMI a 1% à suspensão celular para parar a lise e centrifugue a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Elimine o sobrenadante.
3. Ressuspenda os grânulos celulares em 10 mL de meios de cultura (RPMI 1640 contendo 10% de FBS, 100 U / mL de penicilina / estreptomicina, 2 mM de l-glutamina e 50 mM de β-mercaptoetanol) e ajuste o volume para atingir a concentração final de 2 x 10⁶ células / mL.
4. Adicione 20 ng/mL de fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) à suspensão celular. Cultivar as células da medula óssea em placas de Petri a 100 x 15 mm a 37 °C em CO₂ a 5% durante 6 dias.
5. Substitua metade dos meios de cultura em andamento (cerca de 5 mL) por meios frescos contendo 40 ng/mL GM-CSF no dia 3.
6. Pré-aqueça os meios de cultura em banho-maria a 37 °C. Recolha cerca de 5 ml dos meios das placas de cultura da medula óssea. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em 5 mL de meio de cultura contendo 40 ng/mL GM-CSF.
7. Adicione 25 μg/mL de lipopolissacarídeo (LPS) ao meio no dia 6 da cultura para amadurecer os BM-DCs. Guarde uma alíquota de 2 x 10⁶ células para determinar a eficácia da diferenciação DC por citometria de fluxo.
8. Colete BM-DCs amadurecidos: Use elevadores de células para raspar suavemente os DCs das placas de Petri. Colete todas as suspensões celulares em tubos cônicos de 50 mL. Centrifugar a 800 x g, durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante. Lave os pellets celulares 3x com 50 mL de PBS gelado. Economize cerca de 2 x 10⁶ BM-DCs para análise de fenótipo imunológico por citometria de fluxo.