Geração de células dendríticas derivadas da medula óssea: um método para gerar células dendríticas a partir da medula óssea de camundongos

Resumo

Fonte:Nguyen, H. D., et al. Plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas na doença do enxerto contra o hospedeiro. J. Vis. Exp.. (2020).

Este vídeo descreve um protocolo para a geração de células dendríticas - células-chave apresentadoras de antígenos que ativam as células T - da medula óssea de um camundongo adulto.

Protocolo

1. Gerar células dendríticas derivadas da medula óssea (BM-DCs).

1. Isole a medula óssea dos fêmures e tíbias de camundongos WT ou fator B (fB) ^-/- no fundo B6. Resumidamente, colete a tíbia e o fêmur de ambas as pernas usando uma pinça e uma tesoura. Coloque-os em RPMI gelada contendo 1% de FCS e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina e 2 mM de L-glutamina (1% de RPMI) em tubos cônicos de 50 mL. Limpe bem o fêmur e os ossos da tíbia, removendo todos os tecidos musculares usando uma pinça e uma tesoura. Transferir o fémur e a tíbia dos tubos cónicos de 50 ml para uma placa de Petri de 92 mm de diâmetro contendo 1% de RPMI. Usando uma tesoura, corte as pontas do fêmur ou da tíbia. Encha um tubo de 50 mL com 25 mL de meio RPMI 1640 a 1%. Use-o para encher uma seringa de 3 mL conectada a uma agulha de 26 G com 3 mL de RPMI a 1%. Insira esta seringa no osso e empurre o êmbolo para liberar a medula óssea (MO) para fora da cavidade para o tubo de coleta com 1% RPMI (~ 3 mL / osso). Gire as células a 800 x g por 5 min.
2. Ressuspenda o pellet em 5 mL de tampão de lise ACK para lise de glóbulos vermelhos. Incubar a suspensão celular por 5 min no gelo. Adicione 10 ml de RPMI a 1% à suspensão celular para parar a lise e centrifugue a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Elimine o sobrenadante.
3. Ressuspenda os grânulos celulares em 10 mL de meios de cultura (RPMI 1640 contendo 10% de FBS, 100 U / mL de penicilina / estreptomicina, 2 mM de l-glutamina e 50 mM de β-mercaptoetanol) e ajuste o volume para atingir a concentração final de 2 x 10⁶ células / mL.
4. Adicione 20 ng/mL de fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) à suspensão celular. Cultivar as células da medula óssea em placas de Petri a 100 x 15 mm a 37 °C em CO₂ a 5% durante 6 dias.
5. Substitua metade dos meios de cultura em andamento (cerca de 5 mL) por meios frescos contendo 40 ng/mL GM-CSF no dia 3.
6. Pré-aqueça os meios de cultura em banho-maria a 37 °C. Recolha cerca de 5 ml dos meios das placas de cultura da medula óssea. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em 5 mL de meio de cultura contendo 40 ng/mL GM-CSF.
7. Adicione 25 μg/mL de lipopolissacarídeo (LPS) ao meio no dia 6 da cultura para amadurecer os BM-DCs. Guarde uma alíquota de 2 x 10⁶ células para determinar a eficácia da diferenciação DC por citometria de fluxo.
8. Colete BM-DCs amadurecidos: Use elevadores de células para raspar suavemente os DCs das placas de Petri. Colete todas as suspensões celulares em tubos cônicos de 50 mL. Centrifugar a 800 x g, durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante. Lave os pellets celulares 3x com 50 mL de PBS gelado. Economize cerca de 2 x 10⁶ BM-DCs para análise de fenótipo imunológico por citometria de fluxo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10X PBS	Fisher Científico	BP3994	Buffer MACS
Camundongos B6 fB-/-	Universidade da Flórida Central	Em casa	Destinatários
B6. Camundongos Ly5.1 (CD45.1 +)	Rio Charles	546	Doadores
Ratos BALB/c	Rio Charles	28	Receptores de transplante
Camundongos C57BL/6	Rio Charles	27	Doadores/Receptores
Soro fetal bovino (FBS)	Sistema de P&D da Atlanta Bilogicals	D17051	Cultura de células
Lipopolissacarídeo (LPS)	Millipore Sigma	L4391-1MG	DC maduro
Incubadora New Brunswick Galaxy 170R	Eppendorf	Galáxia 170 R	Cultura de células
Penicilina + estreptomicinaPenicilina / estreptomicina (10.000 unidades de penicilina / 10.000 mg / ml de estreptococos)	GIBCO	Rolamento 15140	mídia
RPMI 1640	Thermo Fisher Scienctific	11875-093	mídia