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1. Fixação, Lise Celular e Cisalhamento da Cromatina
NOTA: As amostras de pacientes e células Jurkat são fixadas e lisadas com um kit ChIP disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante com modificações conforme descrito anteriormente. A fixação é realizada sob uma capela de fluxo laminar.
- Prepare um tubo de 1,5 mL com 1 mL de formaldeído a 37%, um tubo de 1,5 mL com 1 mL de glicina 1,25 M, um tubo de 5 mL com 4 mL de 1x PBS e uma caixa com gelo para a fixação das células.
- Após a estimulação das células pelo respectivo tempo de incubação, Estimule as células adicionando 32,4 nM de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e 1 μM de ionomicina. Em seguida, incubar as células por 16 h a 37 ° C e 5% de CO2 com a tampa do tubo aberta (para evitar contaminação, pode-se usar um filme de vedação permeável ao ar, girar os tubos de 5 mL a 200 x g por 5 min e ressuspender as células em 500 μL de PBS nos tubos de 5 mL.
- Adicione 340 μM de formaldeído (13,5 μL de 37% de formaldeído) às células. Após uma breve mistura, pipetando cuidadosamente para cima e para baixo, incube a suspensão por 2,5 min (células Jurkat) ou 5 min (amostra do paciente) à temperatura ambiente.
nota: É necessário um tempo de fixação prolongado para que as células primárias garantam o cisalhamento ideal.
- Adicionar 125 mM de glicina (57 μL de glicina 1,25 M) para interromper a fixação e incubar durante mais 5 min. Colocar as células no gelo imediatamente a seguir e centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Retirar o sobrenadante por aspiração.
- Lave as células duas vezes com 1 mL de PBS gelado a 200 x g por 5 min a 4 °C e remova o sobrenadante todas as vezes por aspiração.
nota: Após a fixação, o protocolo pode ser pausado. As células fixas devem ser armazenadas a -80 °C. Para testar, se o epítopo do anticorpo destinado a ser usado no protocolo a seguir não for mascarado por meio de fixação, amostras adicionais podem ser usadas para análise via eletroforese em gel SDS-PAGE e Western blot. Essas etapas são realizadas com 100 μg de proteína de acordo com as instruções do fabricante. Todos os anticorpos αNFAT2 são usados em uma diluição de 1:1000, o anticorpo GAPDH em uma diluição de 1:10000. Uma imagem exemplar de amostras fixas de células Jurkat com anticorpos apropriados e inadequados é mostrada na Figura 1.
- Ressuspenda o pellet celular em 5 mL de tampão de lise 1 disponível comercialmente pipetando para cima e para baixo. Em seguida, coloque as amostras no gelo em uma coqueteleira e incube-as por 10 min agitando.
nota: Antes da lise, as células podem ser desintegradas por 10 s em nitrogênio líquido. Isso é útil para células de Jurkat, mas deve ser evitado em amostras primárias de pacientes. Para a desintegração, coloque os tubos de 5 mL por 5 s em 5-10 mL de nitrogênio líquido em um recipiente específico. Use óculos de segurança e luvas de segurança adequadas.
- Em seguida, centrifugar os tubos a 500 x g durante 5 min a 4 °C e remover cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem.
- Homogeneizar as células em 5 mL de tampão de lise 2 disponível comercialmente pipetando para cima e para baixo e incubar por 10 min no gelo enquanto agita. Em seguida, centrifugue os tubos a 500 x g durante 5 min a 4 °C e retire cuidadosamente o sobrenadante pipetando.
- Ressuspenda o pellet celular em 500 μL (células Jurkat) ou 140 μL (amostras de pacientes) de tampão de cisalhamento 1 contendo 1x inibidor de protease (5 μL ou 1,4 μL, respectivamente) e incube a mistura por 10 min em gelo.
- Para cisalhamento da cromatina, transfira 140 μL da suspensão celular da etapa 1.9 para os tubos do sonicador (evite produzir bolhas de ar e repita esta etapa, se necessário, devido ao volume da amostra). Coloque os tubos no ultra-sonicador focalizado a uma temperatura de 7 ° C e cisalhe por 10 min (linha celular) ou 7,5 min (amostras de pacientes) com uma potência incidente média de 9,375 W para obter fragmentos de DNA de 200-500 pb.
- Por fim, centrifugue a 15700 x g durante 10 min a 4 °C na centrífuga pequena e recolha o sobrenadante num novo tubo de 1,5 ml.
- Para testar os tamanhos de fragmentos apropriados, analise 20 μL da cromatina cisalhada por meio de eletroforese em gel de agarose TBE a 1,5%. Uma imagem exemplar da cromatina cisalhada de células Jurkat de boa e má qualidade é mostrada na Figura 2. Neste ponto, o protocolo pode ser potencialmente pausado. A cromatina cisalhada deve ser conservada a -80 °C.
