Ensaio de imunoprecipitação de cromatina: uma técnica para estudar interações proteína-DNA em células

Resumo

Fonte: Fuchs, A. R.,et al. Um ensaio de imunoprecipitação de cromatina para identificar novos genes-alvo NFAT2 na leucemia linfocítica crônica. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo descreve o protocolo para ensaio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP), que é uma técnica clássica para demonstrar interações proteína-DNA. Esta técnica é usada para identificar genes-alvo em células de leucemia linfocítica crônica humana.

Protocolo

1. Imunoprecipitação da cromatina

NOTA: A imunoprecipitação da cromatina foi realizada com um kit ChIP disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante com modificações.

1. Calcule o número de imunoprecipitações (70 μL (células de Jurkat) ou 15 μL (amostras de pacientes) de cromatina cisalhada mais um anticorpo) e prepare 20 μL de grânulos revestidos de proteína A por precipitação em um tubo de 1,5 mL. Lave os grânulos em 40 μL de 1x tampão ChIP 1 por precipitação pipetando para cima e para baixo, deixe os grânulos descansarem em um rack magnético por 1 min e remova o sobrenadante pipetando. Execute esta etapa quatro vezes no total. Eventualmente, ressuspenda as contas no volume original com 1x buffer ChIP 1.
2. Para a imunoprecipitação propriamente dita, utilizar 10 μg do anticorpo αNFAT2 (7A6) para capturar o NFAT2 com as suas sequências-alvo ligadas. Use 2,5 μg de um anticorpo IgG de coelho (DA1E) como controle de IgG. Preparar as reações em tubos frescos de 1,5 mL, conforme indicado na Tabela 1.
   NOTA: É importante usar um anticorpo monoclonal com alta afinidade cujo epítopo não seja mascarado durante a fixação para este protocolo. Os anticorpos policlonais introduzem um nível adicional de variação, tornando significativamente mais difícil interpretar adequadamente os resultados recebidos.
3. Incubar a mistura do passo 1.2 durante a noite a 4 °C numa roda rotativa a 6 rpm.
4. No dia seguinte, gire os tubos por 5 s a 7.000 x g na centrífuga pequena, incube-os em um rack magnético por 1 min e remova o sobrenadante por aspiração. Lave as contas uma vez com cada um dos tampões de lavagem 1, 2, 3 e 4 consecutivamente.
5. Para isso, ressuspender os grânulos em 350 μL de tampão de lavagem e incubá-los por 5 min a 4 °C em uma roda giratória a 6 rpm.
6. Depois disso, gire os tubos por 5 s a 7000 x g na centrífuga pequena. Em seguida, coloque-os por 1 min em um rack magnético, remova o sobrenadante e adicione o próximo tampão de lavagem.
7. Após a última etapa de lavagem, remover o sobrenadante por pipetagem, pegar os grânulos em 100 μl de tampão de eluição 1 e incubá-los por 30 min em uma roda giratória a 6 rpm.
8. Gire os tubos rapidamente (5 s a 7000 x g na centrífuga pequena) e coloque-os em um rack magnético por 1 min.
9. Em seguida, transfira o sobrenadante pipetando para um novo tubo de 1,5 ml e adicione 4 μL de tampão de eluição 2.
10. Para criar o controle de entrada, misture 1 μL da cromatina cisalhada com 99 μL de tampão de eluição 1 e 4 μL de tampão de eluição 2 (nesta configuração, há três tubos por paciente: um controle de entrada, um controle de IgG e uma amostra αNFAT2).
11. Incubar as amostras durante 4 h a 65 °C e 1300 rpm num agitador de tubos de 1,5 ml. Adicione 100 μL de isopropanol 100%, vórtice e gire as amostras por 5 s a 7000 x g na centrífuga pequena.
12. Ressuspenda os grânulos magnéticos disponíveis por vórtice completo, adicione 10 μL dos grânulos a cada amostra e incube por 1 h à temperatura ambiente em uma roda giratória a 6 rpm.
13. Após a incubação, gire os tubos por 5 s a 7000 x g na centrífuga pequena e coloque-os por 1 min em um rack magnético. Remover o sobrenadante por aspiração.
14. Ressuspenda os grânulos em 100 μL de tampão de lavagem 1. Inverta os tubos para misturar e incubar por 5 min em temperatura ambiente em uma roda giratória a 6 rpm.
15. Gire os tubos por 5 s a 7000 x g na centrífuga pequena, coloque-os por 1 min em um rack magnético e remova o sobrenadante por pipetagem. Repita as etapas 2.13-2.14 com tampão de lavagem 2.
16. Em seguida, remover o tampão de lavagem por aspiração, ressuspender os grânulos em 55 μL do tampão de eluição e incubar durante 15 min à temperatura ambiente na roda rotativa a 6 rpm para eluir o ADN precipitado. Finalmente, gire os tubos por 5 s a 7000 x g na centrífuga pequena, coloque-os por 1 min em um rack magnético e transfira o sobrenadante para novos tubos de 1,5 mL.
    nota: Aqui, o protocolo pode ser potencialmente pausado. O ADN eluído deve então ser armazenado a -20 °C.

item	volume (μL) por IP
5% BSA	6
100 x inibidor de protease	3
5 x buffer ChIP 1	56
cromatina cisalhada	x (15 μL ou 70 μL)
Grânulos magnéticos revestidos com proteína A	20
Água de grau ChIP seq	185-X-Y
anticorpo (controle αNFAT2 ou IgG)	y (1,09 μL ou 1 μL)
total	270

Tabela 1: Cronograma para pipetagem da imunoprecipitação da cromatina. A imunoprecipitação da cromatina foi realizada preparando-se as reações conforme indicado na tabela.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo anti-NFAT2	Alexis	1008505	Clone 7A6
Anticorpo anti-NFAT2	Sinalização Celular	8032S	Clone D15F1
Anticorpo anti-NFAT2 ChIP Grade	Abcam	AB2796	Clone 7A6
Rack magnético, ímã DynaMag-15	Thermo Científico	12301D	Pode ser substituído por instrumentos semelhantes
Kit iDeal ChIp-seq para histonas	Diagenode	C01010059
Centrífuga pequena	Thermo Científico	Afresco de Heraeus 17	Pode ser substituído por instrumentos semelhantes
Agitador Duomax 1030	Instrumentos Heidolph	Rolamento 543-32205-00	Pode ser substituído por instrumentos semelhantes
Coquetel de Inibidores de Protease e Fosfatase Halt (100X)	Thermo Científico	Nº 78440
IRDye 680LT IgG anti-coelho para burros (H + L), 0,5 mg	LI-COR Biociências	926-68023
IRDye 800CW IgG anti-rato de cabra (H + L), 0,1 mg	LI-COR Biociências	Rolamento 925-32210
Tubo DNA LoBind 1,5 mL	Eppendorf	22431021
FBS superior	Merck	S0615
37 % Formaldeído p.a., ACS	Roth	4979.1
1 x PBS	Sigma Aldrich	D8537
M220 Ultrasonicator focalizado	Covaris	500295
20X Parafuso MES SDS Buffer de Corrida	Thermo Científico	B0002
Solução salina tamponada Tris (TBS-10X)	Sinalização Celular	#12498
Dispositivo de transferência de gel iBlot 2	Thermo Científico	IB21001
iBlot 2 Pilhas de Transferência, nitrocelulose, tamanho normal	Thermo Científico	B23001
Centrífuga grande	Eppendorf	5804R	Pode ser substituído por instrumentos semelhantes