Cultivo e colheita de clones HSPC: um método para obter os clones HSPC classificados individualmente

Resumo

Fonte: Huber, A. R., et al. Caracterizando a Carga Mutacional e a Composição Clonal do Sangue Humano. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo descreve o protocolo para isolar HSPCs da medula óssea e classificá-los usando uma técnica de classificação de células ativadas por fluorescência, que é um método para obter HSPCs individualmente classificados. Cultivamos essas células selecionadas para obter clones de HSPC.

Protocolo

1. Isolamento, classificação e cultura do HSPC

1. Gire para baixo em 1–2 x 10⁷ células mononucleares por 5 min a 350 x g e ressuspenda em 50 μL de tampão FACS. Ressuspenda o pellet celular em 100 μL de solução de coloração anti-CD3 (diluição 1:100 do anticorpo anti-CD em tampão FACS). Transfira as células para um tubo de microcentrífuga.
   NOTA: Ao classificar com >2 x 10⁷ células, aumente a mistura de anticorpos e os volumes de tampão FACS de acordo.
2. Prepare 50 μL de mistura de coloração 2x HSC de acordo com a receita vista na Tabela 1
3. Misture 50 μL de solução celular com a mistura de coloração HSC preparada e incube as células por 15 min à temperatura ambiente (RT) ou por 1 h em gelo para que os anticorpos se liguem.
4. Lave as células adicionando 1 mL de tampão FACS e pellet centrifugando por 5 min a 350 x g.
5. Ressuspenda as células em 300 μL de tampão FACS e filtre a suspensão celular através de um tubo de poliestireno de 5 mL com tampa de filtro de células de 35 μm para remover aglomerados de células antes da classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).
6. Prepare 25 mL de meio de cultura HSPC, consistindo em 1x meio SFEM suplementado com 100 ng/mL SCF, 100 ng/mL Flt3, 50 ng/mL TPO, 10 ng/mL IL-3, 20 ng/mL IL-6 e 100 ng/mL formulação antibiótica (ver Tabela de Materiais).
7. Encha uma placa de cultura de células de 384 poços com 75 μL de meio de cultura HSPC em cada poço.
   NOTA: Para evitar a evaporação do meio nos poços externos, encha os poços externos com 75 μL de água estéril ou PBS e não use esses poços para classificação de células.
8. Classificação de HSPCs individuais
   1. Defina portões para a classificação do HSPC com base em um controle não corado (HSCs classificados individualmente) e 10.000 células da amostra corada. Um resultado representativo para a configuração de portões é representado na Figura 1. Gate células únicas desenhando uma porta ao redor da fração linear de altura FSC vs. área FSC. Use a fração de controle não corada para desenhar a porta para a fração ^de linhagem. Desenhe portas para células CD34⁺ e caracterize ainda mais esse subconjunto definindo uma porta específica para células CD38-CD45RA-.
   2. Carregue a placa de 384 poços na máquina FACS e classifique as células individuais.
      NOTA: Se aplicável à máquina FACS, ative a opção de manter os dados de classificação de índice para permitir o rerastreamento das células classificadas.
9. Cultivo de HSCs classificados individualmente
   1. Transfira diretamente a placa de 384 poços para uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO₂.
      nota: Para evitar a evaporação durante a cultura, embrulhe a placa de cultura de 384 poços (com tampa) em filme de polietileno transparente.
   2. Mantenha a placa de 384 poços na incubadora por 3 a 4 semanas até que os clones visíveis apareçam. Imagens representativas da cultura clonal são representadas na Figura 2. Com base na condição do material de entrada, 5% a 30% das células classificadas se expandirão clonalmente.

anticorpo	volume [μL]
BV421-CD34	5
Mistura de linhagem FITC (CD3/14/19/20/56)	5
PE-CD38	algarismo
APC- CD90	0,5
PerCP/Cy5.5 - CD45RA	5
PE/Cy7- CD49f	1
FITC -CD16	1
FITC-CD11	5
Buffer FACS	25,5

Tabela 1: Mistura de classificação HSC.É mostrada uma tabela indicando as diluições de anticorpos usados para classificar os HSCs.

2. Colhendo clones HSPC

1. Após 4 semanas de cultivo, determine quais poços têm uma confluência de 30% ou mais.
2. Pré-encha (para cada crescimento clonal) microtubos de 1,5 mL com 1 mL de BSA a 1% em PBS e rotule o tubo de acordo com o poço correspondente.
3. Umedeça previamente uma ponta de pipeta com 1% de BSA em PBS para minimizar o número de células aderidas à ponta da pipeta.
4. Pipetar para cima/para baixo no meio no poço ferozmente (pelo menos 5 vezes) com uma pipeta de 200 μL (ajustada em 75 μL) e raspar o fundo do poço para soltar as células do poço e coletar a suspensão celular no microtubo marcado correspondente ao poço.
5. Pegue 75 μL de BSA fresco a 1% em PBS e repita a pipetagem no poço para garantir a máxima absorção das células.
   NOTA: As células cultivadas clonalmente podem grudar no fundo do poço. Inspecione os poços usando um microscópio de luz invertida padrão para garantir que todas as células foram coletadas.
6. Se todos os poços com >30% de confluência tiverem sido colhidos, coloque a placa de 384 poços de volta na incubadora. As culturas clonais podem proliferar por até 5 semanas.
7. Gire a suspensão celular por 5 min a 350 x g. Um pequeno pellet deve estar visível.
8. Remova cuidadosamente tudo, exceto cerca de 5 μL de sobrenadante. Os pellets celulares podem ser congelados a -20 °C e armazenados por vários meses antes do isolamento do DNA.

Resultados

Figura 1: Fluxograma que descreve o procedimento experimental com base no material de entrada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Estraté...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
CD11c FITC	BioLegend	301603	Clone 3.9
CD16 FITC	BioLegend	302005	Clone 3G8
CD3 BV650	BioLegend	300467	Clonar UCHT1
CD34 BV421	BioLegend	343609	561
CD38 PE	BioLegend	303505	Clone HIT2
CD45RA PerCP/Cy5.5	BioLegend	304121	Clone HI100
CD49f PE/Cy7	BioLegend	313621	Clone GoH3
CD90 APC	BioLegend	328113	Clone 5E10
Filtro de célula Tubo de 5 mL	Corning	352235
Placa CELLSTAR, 384 W, 130 μL, fundo em F, TC, tampa	Greiner	781182
Ligante Flt3 humano, grau premium	Miltenyi Biotech	130-096-479	Rereconhecimento em alíquotas de uso único (25 μL) a 100 μg/mL em BSA 0,1% em PBS
IL-3 recombinante humana (expressa por E. coli)	Tecnologias de células-tronco	Rolamento 78040.1	Rereconhecimento em alíquotas de uso único (2,5 μL) a 100 μg/mL em BSA 0,1% em PBS
IL-6 recombinante humana (E. coliexpress)	Tecnologias de células-tronco	Rolamento 78050.1	Rereconhecimento em alíquotas de uso único (5 μL) a 100 μg/mL em BSA 0,1% em PBS
SCF humano, grau premium	Miltenyi Biotech	130-096-695	Rereconhecimento em alíquotas de uso único (25 μL) a 100 μg/mL em BSA 0,1% em PBS
TPO humano, grau premium	Miltenyi Biotech	130-095-752	Rereconhecimento em alíquotas de uso único (12,5 μL) a 100 μg/mL em BSA 0,1% em PBS
Linhagem (CD3/14/19/20/56) FITC	BioLegend	348701	Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56
Pbs			Feito nas instalações do Instituto. PBS comercialmente disponível também pode ser usado
Primocin	Invivogen	formiga-pm-1	Formulação antibiótica