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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
Isolamento de células c-Kit+ da medula óssea
- Sacrifique os ratos de acordo com as diretrizes institucionais.
NOTA: Aqui, os camundongos foram expostos ao dióxido de carbono (CO2) de acordo com a taxa de fluxo recomendada pela AVMA até que a morte fosse determinada pela cessação da respiração e dos batimentos cardíacos, seguida de luxação cervical.
- Colha os ossos da perna do camundongo - dois fêmures, duas tíbias, dois ilíacos. Limpe todos os tecidos dos ossos raspando com um bisturi. Coloque os ossos da perna em 1x PBS frio no gelo - 5 mL em um tubo de 15 mL. Despeje o conteúdo do tubo em um pilão e esmague-o com um pilão.
- Filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 70 μm em um tubo de tampa de rosca de 50 mL com uma pipeta de 10 mL conectada, usando uma pipeta. Lave o almofariz e o pilão várias vezes com PBS 1x frio, coletando e adicionando suspensão celular ao tubo de 50 mL. Gire a medula óssea a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min. Remova o sobrenadante por meio de um vácuo com uma pipeta de vidro acoplada. Suspenda o pellet celular em 5 mL de 1x PBS com uma pipeta.
- Com uma pipeta, adicione lentamente a medula óssea suspensa ao topo de 5 mL de polissacarose em temperatura ambiente (a temperatura é crítica), tomando muito cuidado para não perturbar a interface. Gire a 400 x g em temperatura ambiente por 20 min com o freio desligado.
- Colete a interface de célula mononuclear total turva (TMNC) com uma pipeta e coloque-a em um novo tubo de 15 mL. Aumente o volume para 10 mL com 1x PBS para a lavagem, levando 20 μL para contagem, e gire a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min. Rejeitar o sobrenadante e guardar o sedimento no gelo para o passo 4.6.1.
- Execute o isolamento de células c-Kit+.
- Siga um protocolo de kit de microesferas para o isolamento de células c-Kit+. Ressuspenda o pellet celular em 80 μL de 1x PBS + EDTA + BSA para 107 células. À suspensão celular, adicione 20 μL de CD117 MicroBeads/107 células totais. Misture bem por vórtice e incube por 10 min a 4 ° C. Aumente o volume para 10 mL adicionando 1x PBS + EDTA + BSA e gire a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min.
- Remova o sobrenadante por meio de vácuo e suspenda o pellet celular em 500 μL / 108 células totais em 1x PBS + EDTA + BSA. Usando o suporte magnético com a coluna magnética conectada, adicione 3 mL de 1x PBS + EDTA + BSA e deixe-o fluir por gravidade para um tubo de coleta de 15 mL.
- Assim que a primeira adição de tampão terminar de passar pela coluna, adicione a suspensão da célula à coluna, permitindo que ela flua por gravidade para o tubo de coleta de 15 mL. Esse fluxo é a fração celular indesejada.
- Lave a coluna 3 vezes com 3 mL 1x PBS + EDTA + BSA de cada vez, permitindo que ela flua por gravidade para o tubo de coleta. Remova a coluna do ímã e coloque no topo de um tubo de 15 mL.
- Adicione 5 mL de 1x PBS + EDTA + BSA e lave-o imediatamente com o êmbolo fornecido com a coluna. Remova o êmbolo e repita a lavagem com mais 5 mL de 1x PBS + EDTA + BSA. Conte as células no volume total usando métodos padrão.
- Gire as células a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em IMDM completo (IMDM + 10% FBS + IL-6 [10 ng / mL] + mSCF [50 ng / mL] + ligante FLT3 [20 ng / mL] + IL-3 [10 ng / mL]) para cultura. Cultive essas células durante a noite em 2 x 106 células/1 mL de meio IMDM celular, colocando-as em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2.