Transdução mediada por retrovírus: um método para introduzir o gene alvo em células cancerígenas

Resumo

Fonte: Kesarwani, M., et al. Métodos para avaliar o papel de c-Fos e Dusp1 na dependência de oncogenes. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo descreve o protocolo de validação genética por meio da transferência de genes-alvo usando retrovírus em linhagens celulares de leucemia mieloide crônica. Os retrovírus atuam como um mediador para transferir material genético para a célula de leucemia por meio do processo chamado transdução, que permite a expressão a longo prazo do gene alvo. Este método pode ser aplicado a qualquer célula-alvo para validação genética e desenvolvimento terapêutico.

Protocolo

1. Transdução

1. Transfecção de plasmídeo retroviral
   1. Descongele as células HEK293 na tarde anterior em banho-maria regulado para 37 °C. Gire o criotubo contendo as células HEK a 435 x g à temperatura ambiente por 3 min. Remova o sobrenadante por meio de vácuo e suspenda o pellet celular em 1 mL de DMEM suplementado com 10% de FBS, penicilina, estreptomicina e glutamina.
   2. Conte as células e adicione o volume apropriado a um prato tratado de 10 cm (~ 4 x 10⁶ HEK293T células). Adicione 14 mL do meio DMEM 10 ao prato e misture bem deslizando para cima e para baixo para uma distribuição igual. Coloque o prato em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ durante a noite.
   3. Na manhã seguinte, verifique a confluência das células em um microscópio de luz invertida (50% ou mais funciona bem).
   4. Combine o DNA (plasmídeo retroviral desejado), PclEco (plasmídeo de embalagem), 2 M CaCl₂ e H₂0 em um tubo de 1,5 mL (= 500 μL) usando uma micropipeta nas seguintes quantidades: 7,5 μg de DNA (BCR-ABL1-YFP), 7,5 μg de pCLeco, 62 μL de 2 M CaCl₂ e água até um volume final de 500 μL. Adicione 500 μL de 2x HBS a outro tubo de 1,5 mL.
   5. Adicione a mistura de DNA gota a gota ao tubo de 1,5 mL contendo 500 μL de 2x HBS (280 mM NaCl, 100 mM HEPES e 1,5 mM Na₂HPO₄) durante a mistura. Consiga isso definindo um vórtice para a velocidade mais baixa e segure o tubo HBS nele para mistura constante enquanto adiciona a mistura de transfecção.
   6. Deixe a mistura de transfecção incubar por 20 a 30 minutos em temperatura ambiente. Durante a incubação, adicione 25 nM de cloroquina às células HEK e coloque-as de volta na incubadora. Após a incubação, adicione a mistura de transfecção gota a gota às células HEK e, em seguida, agite suavemente o meio para misturar a mistura de transfecção em toda a placa.
   7. Incubar as células com a mistura durante ~8 h numa incubadora a 37 °C, CO_{5 2}. Troque o meio nessas células adicionando muito lentamente 14 mL de meio DMEM 10 fresco. A pipetagem lenta contra a parede do prato ajuda a evitar qualquer remoção das células HEK. Incubar as células durante a noite na incubadora de CO₂ a 37 °C, 5%.
   8. Colete o sobrenadante viral com uma seringa de 10 mL, aspire o sobrenadante para a seringa e coloque o filtro de seringa de 0,45 μm. Mergulhe o sobrenadante viral em um novo tubo de coleta. Faça a primeira coleta de sobrenadante viral ~ 16 h depois.
2. Concentração e transdução viral de fibronectina
   1. Adicione 2 mL de um fragmento de fibronectina humana recombinante de 0,1 mg em 1x PBS a placas de cultura de 6 poços não tratadas. Prepare a quantidade de fibronectina necessária, que depende do número de células e genótipos. Um poço pode transduzir suficientemente 10 milhões de células c-Kit+. Incubar a placa durante a noite a 4 °C.
   2. No dia seguinte, remova a fibronectina dos poços com uma pipeta, pipete 2 mL de BSA estéril a 2% em 1x PBS para bloquear a placa e incube por 30 min em temperatura ambiente. Remova o BSA por meio de um aspirador e lave bem pipetando 2 mL de 1x PBS e, em seguida, remova-o por meio de um aspirador.
   3. Adicione imediatamente o sobrenadante viral recém-coletado e filtrado (a 0,45 μm) até 5 mL. Centrifugar a 435 x g a 32 °C durante 2 h. Remova o sobrenadante por meio de um vácuo e repita esta etapa com sobrenadante viral recém-coletado adicional e gire novamente. Remova o sobrenadante por meio de vácuo e lave os poços adicionando 2 mL de 1x PBS; Em seguida, remova-o a vácuo.
   4. Adicione as células de camundongo c-Kit+ que foram cultivadas durante a noite, girando as células e ressuspendendo o pellet no IMDM completo, para cultura. Cultive essas células durante a noite em 2 x 10⁶ células / 1 mL de meio completo IMDM celular, colocando-as em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO₂) para os poços revestidos virais, misturando bem as suspensões celulares e pipetando-as na placa de fibronectina concentrada agora viral. Gire a 1.200 x g a 25 °C por 90 min. Colocar as células numa incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
   5. 48 h após a transdução, peletizar as células por centrifugação a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min e ressuspendê-las no tampão FACS # 1 (1x PBS + 0,5% BSA) a 6 x 10⁶ / mL. Determine a porcentagem de células positivas para BCR-ABL1 medindo a porcentagem de YFP positivo usando citometria de fluxo.
   6. Adquira eventos com o procedimento padrão. Primeiro, bloqueie as células vivas com base na dispersão direta e lateral. Em seguida, bloqueie as células vivas positivas para YFP, excluindo as células negativas para YFP determinadas por controle negativo (Figura 1).

Resultados

Figura 1: FACS mostrando a frequência de células YFP+ do sangue de um camundongo transplantado e de um camundongo WT (controle negativo). Os painéis superiores mostram um gráfico de dispersão das células e do gating. Os painéis inferiores mostram histogramas de YFP vs. dispersão lateral. As células com IMF de >10³ foram consideradas YFP...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
Fragmento de fibronectina humana recombinante RetroNectin	Takara	T100B
FBS	Atlanta biológico	S11150
Penn / Strep	Cellgro (corning)	30-002-CI
L-Glutamina	Cellgro (corning)	25-005-CL	5 mg/mL de estoque em água
HEPES	sigma	H7006
Pbs	Corning	21040CV
Na2HPO4.7H2O	sigma	S9390
Cloreto de cálcio	Invitrogen	K278001
2x HBS	Invitrogen	K278002
Edta	Ambion	AM9261
Bsa	sigma	Rolamento A7906
Ensaio de célula de início de cultura humana de longo prazo	Tecnologias de células Stemp
Contador de células automatizado TC-10	Bio-RAD
ROSACreERT2/c-Fos fl/fl Dusp1-/-	Feito em casa
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Feito em casa
ROSACreERT2	Laboratório Jackson
C57Bl/6	Laboratório Jackson
Células CML-CD34+ e CD34+ normais	Hospital Universitário, Universidade de Cincinnati
LSR II (analisador FACS)	Bd
Fortessa I (analisador FACS)	Bd
FACSAriaII (Classificador FACS)	Bd
Incubadora de CO2 NAPCO série 8000 WJ	Termocientífico
Rotor de caçamba oscilante 5810R	Eppendorf
Seringa de insulina 1/2 cc Lo-Dose u-100 28 G1/2	Becton Dickinson	Becton Dickinson
Hemisuccinato de Hidrocortisona Sódica	Tecnologias de células-tronco	Nº 7904
GM-CSF	Especificações	CYT-221
G-SCF	Especificações	CYT-220
IL-3 humana	Especificações	CYT-210
SCF humano	Especificações	CYT-255
Eritropoieína	Amgen	Rolamento 5513-267-10
BD Perm/Wash (permeabilização e solução de lavagem para fluxo de fosfo)	Bd	554723
BD Cytofix/Cytoperm (solução de fixação e permeabilização)	Bd	554714
BD Pharm Lyse	Bd	555899
Estrela de células de nylon de 70 μm	Becton Dickinson	Rolamento 352350
Filtro de disco acro de 0,45 μM	Pall	2016-10