Ensaio de UFC à base de metilcelulose: um método para determinar o efeito de compostos anticancerígenos na formação de colônias em células leucêmicas

Resumo

Fonte: Kesarwani, M., et al. Métodos para avaliar o papel de c-Fos e Dusp1 na dependência de oncogenes. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo descreve o protocolo para unidade de formação de colônias à base de metilcelulose ou ensaio UFC, que ajuda a identificar e contar o número de colônias formadas por células leucêmicas em resposta ao tratamento com compostos anticancerígenos.

Protocolo

1. Ensaios de Unidade Formadora de Colônias

1. Descongele a metilcelulose com citocinas para camundongos em temperatura ambiente por 1–2 h. Alíquota 3 mL de metilcelulose em um tubo FACS usando uma seringa de 5 mL sem agulha. Classifique as células positivas para YFP em um classificador de células.
2. Gire as células para baixo e suspenda o pellet na mídia completa IMDM. Conte as células a serem plaqueadas e dilua-as para obter 5.000 células YFP-positivas em 100 μL de meio IMDM completo.
3. Adicione 100 μL da suspensão celular contendo 5.000 células YFP-positivas e os inibidores apropriados a 3 mL de metilcelulose. Vórtice em alta para misturá-lo por 10–30 s.
4. Depois que a maioria das bolhas de ar tiver escapado, use uma seringa de 1 mL para colocar 1 mL de mídia em três placas replicadas de 3 cm, ejetando a mídia de um lado e inclinando lentamente a placa em movimentos circulares para espalhar uniformemente.
5. A concentração final dos inibidores a serem usados é imatinibe a 3 μM, DFC a 0,2 μM e BCI a 0,5 μM, isoladamente ou em combinações. Sempre que apropriado, exclua o c-Fos plaqueando as células com 4-hidroxitamoxifeno (1 μg / mL) adicionado à metilcelulose.
6. Após o revestimento, coloque as placas em uma placa de Petri grande com uma placa aberta contendo 2 mL de água estéril no meio. Cubra a placa de Petri grande e incube cuidadosamente na incubadora de CO₂ a 37 °C, 5%. Registre o número de colônias após uma semana de plaqueamento, contando o número total de colônias ao microscópio.
7. Analise algumas colônias de placas apropriadas para deleção de c-Fos por PCR. Colete as colônias sugando-as com uma ponta P1000. Desaloje as células em 500 μL de 1x PBS lavando a ponta no PBS várias vezes. Gire as suspensões celulares a 6.000 x g por 1 min e extraia o DNA do pellet celular usando um kit de isolamento de DNA genômico.
8. Use o DNA genômico para PCR usando os primers mFos-FP3 e mFos-RP5. Analise os produtos de PCR em um gel de agarose a 2% e imagem usando um sistema de documentação de gel.
9. Para uma apresentação gráfica das colônias, corar as colônias, usando cloreto de iodonitrotetrazólio. Dissolva 10 mg do cloreto de iodonitrotetrazólio em 10 mL de água para obter uma solução de 1 mg / mL. Esterilize a solução por filtro usando um Luer lock com um filtro de 0,2 μm conectado a uma seringa de 10 mL em condições estéreis em uma capa de cultura de tecidos.
10. Na capa de cultura de tecidos, adicione 100 μL de solução de coloração gota a gota ao redor da placa de UFC; tenha cuidado para não deslizar ou perturbar as colônias. Incubar as placas durante a noite numa incubadora de cultura de células a 37 °C, 5% de CO₂. As colônias ficarão marrom-avermelhadas escuras. Usando um fundo branco na capa de cultura de tecidos estéreis, tire fotos da placa de UFC manchada.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
IMDM	Cellgro (corning)	15-016-CVR
MethoCult GF M3434 (metilcelulose para UFC de camundongo)	célula-tronco	3434
4-Hidroxitamoxifeno	sigma	H6278
SCF murino recombinante	Especificações	CYT-275
Ligante murino recombinante Flt3-Ligante	Especificações	CYT-340
IL-6 murina recombinante	Especificações	CYT-350
IL-7 murina recombinante	Peprotech	217-17
Dfc	LKT Laboratórios Inc.	D3420
BCI	Chemzon Científico	NZ-06-195
Imatinibe	LC Laborator	I-5508
1x PBS	Cellgro (corning)	21-040-CV
Seringa de insulina 1/2 cc Lo-Dose u-100 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
Cloreto de iodonitrotetrazólio	sigma	I10406
Instrumentos
Incubadora de CO2 NAPCO série 8000 WJ	Termocientífico
Rotor de caçamba oscilante 5810R	Eppendorf
C-1000 Termociclador	Bio-RAD
ChemiDoc Imaging System (sistema de imagem para géis e western blots)	Bio-RAD	17001401
mouses
ROSACreERT2	Laboratório Jackson
ROSACreERT2/c-Fos fl/fl Dusp1-/	Feito em casa
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Feito em casa