Seleção Imunomagnética Negativa: Um Método para Purificar Células B de Células Mononucleares do Sangue Periférico

Resumo

Fonte: Serra S. et al. Ensaio baseado em HPLC para monitorar o metabolismo de nucleotídeos/nucleosídeos extracelulares em células de leucemia linfocítica crônica humana. J. Vis. Exp. (2016)

O vídeo explica uma maneira de purificar as células B por direcionamento imunomagnético e separação da suspensão de células mononucleares do sangue periférico. O método envolve a marcação de tipos de células indesejadas com anticorpos ou ligantes específicos (ligados a partículas magnéticas) direcionados a proteínas específicas da superfície celular, a serem esgotadas da suspensão celular heterogênea por separação magnética.

Protocolo

1. Purificação de células B leucêmicas por isolamento negativo

1. Ressuspender 10⁷ PBMCs/ml em PBS 0,1 % de albumina de soro bovino (BSA) 2 mM EDTA, pH 7,4 (tampão de isolamento).
2. Adicionar 10 μg de anticorpos primários monoclonais de ratinho anti-CD3, -CD14 e -CD16 para 10⁷ células e incubar durante 30 minutos a 4 °C.
3. Lavar as células com o tampão de isolamento e centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
4. Ressuspender as células no tampão de isolamento a 10⁷ PBMCs/ml.
5. Antes de incubar com as células, ressuspenda as esferas magnéticas de IgG anti-camundongo de ovelhas no frasco. Transfira 100 μl de grânulos por 10⁷ células para um tubo.
6. Adicione 1 ml de tampão de isolamento e coloque o tubo num suporte magnético durante 1 min. Elimine o sobrenadante com uma pipeta de 5 ml.
7. Remova o tubo do ímã e ressuspenda os grânulos lavados em 100 μl de tampão de isolamento.
8. Incube 10⁷ células com 100 μl de esferas magnéticas por 30 min a 4 °C com inclinação e rotação suaves.
9. Coloque o tubo no suporte magnético por 2 min e transfira o sobrenadante com as células CD19 ⁺ / CD5 ⁺ não ligadas para um tubo novo com uma pipeta de 5 ml.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sangue humano
anti-CD3 purificado, -CD14, -CD16	feito internamente		monoclonal de camundongo
Dynabeads ovelhas anti-rato IgG	Invitrogen	11031
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Amresco	E404-200TABS	Comprimidos
albumina de soro bovino (BSA)	Biografia do ID	1000-70	Grau padrão
tampão de isolamento			PBS 0,1% BSA 2 mM EDTA, pH 7,4
Ímã DynaMag-15	Invitrogen	12301D	Separador magnético de esferas Dynal