1. Preparação de soluções-mãe padrão e inibidores
- Para preparar o AMP, pesar 0,00345 g de AMP e dissolva-o em 5 ml de meio sem soro para obter uma solução padrão de 2 mM de AMP.
- Para preparar o ADO, pesar 0,00265 g de ADO e dissolvê-lo em 5 ml de meio isento de soro para obter uma solução-padrão de ADO.
- Para preparar o INO, pesar 0,00268 g de INO e dissolvê-lo em 5 ml de meio isento de soro para obter uma solução-padrão de INO 2 mM.
- Preparar uma solução a 400 μM de AMP, ADO e INO misturando 1 ml da solução-mãe de 2 mM em 4 ml de meio isento de soro (5 ml de volume final).
- Fazer uma diluição 1/4 de cada solução-padrão de 400 μM para obter uma concentração de 100 μM, pipetando 500 μl da solução de 400 μM em 1.500 μl de meio isento de soro (2 ml de volume final).
- Preparar diluições seriadas de cada composto em meio isento de soro para obter as seguintes concentrações: 100 μM - 50 μM - 25 μM - 10 μM - 5 μM - 2,5 μM - 1 μM - 0,5 μM - 0,25 μM.
Nota: Por exemplo, pipetar 1 ml da solução de 100 μM em 1 ml de meio isento de soro (diluição 1:2) para obter uma concentração de 50 μM e proceder às restantes diluições.
- Preparar uma solução-mãe 10 mM de APCP dissolvida em PBS; alíquota e armazenar a - 30 °C.
- Preparar soluções-mãe a 10 mM de cloridrato de EHNA, dCF e dipiridamol dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO); alíquota e armazenagem a -30 °C.
2. Programar o método HPLC
- Prepare um tampão de acetato de amônio 7 mM dissolvendo 0,770 g de acetato de amônio em 2 L de água duplamente desionizada (tampão A). Ajuste para pH 3,0 com ácido clorídrico.
- Prepare um frasco de vidro contendo pelo menos 2 L de acetonitrila ultrapura para HPLC (tampão B) e conecte a coluna de proteção e a coluna à HPLC.
Observação: as colunas e buffers estão em RT durante o uso.
- Faça login no software HPLC e selecione o botão "procurar projeto". Vá para o menu "arquivo" e selecione "novo método" e depois "método do instrumento".
- Programe o método da coluna de equilíbrio conforme a Tabela 1. Defina uma taxa de fluxo de 1.00 ml/min e programe o detector UV para ler a 260 nm. Salve o método do instrumento e selecione novamente "novo método" no menu "arquivo" e depois "conjunto de métodos". Escolha o método do instrumento salvo anteriormente e salve o conjunto de métodos atual com o mesmo nome.
- Repita a etapa 2.3 para programar o método de execução de amostra indicado na Tabela 2. Defina uma taxa de fluxo de 1.00 mL/min e programe o detector UV para ler a 260 nm. Salve o método do instrumento e repita o mesmo procedimento descrito na etapa 4.4 para salvar o conjunto de métodos.
- Selecione o botão "executar amostras", escolha "novo método de conjunto de amostras" no menu "arquivo".
- Selecione a opção "vazio" e insira o número do frasco (no amostrador automático), o nome da amostra, o volume de injeção (50 μl). Selecione o conjunto de métodos salvo anteriormente para a coluna "conjunto de métodos" e insira o tempo total de execução (min).
Nota: Insira o método da coluna de equilíbrio (Tabela 1) na coluna "conjunto de métodos" antes de cada execução de amostra e insira o tempo total de execução (min).
3. Geração de uma curva de calibração padrão para cada composto
- Injectar 50 μl de branco (meio isento de soro específico, que não contém adenosina desaminase) e de cada amostra-padrão, seguindo os métodos descritos nos quadros 1 e 2.
- Utilizar o método da coluna de equilíbrio (Quadro 1) antes de cada ensaio e definir as condições de gradiente descritas no Quadro 2 para obter uma separação adequada dos picos. Consulte a Tabela 3 para obter os tempos de retenção relatados de AMP, ADO e INO nessas condições de HPLC.
- Determine a área de pico de AMP, ADO e INO em diferentes concentrações escolhendo o botão "processar" no software HPLC e, em seguida, a opção "integrar". Como alternativa, selecione manualmente os pontos inicial e final de cada pico.
- Representar graficamente as áreas dos picos em relação à concentração nominal de cada padrão para obter a curva de calibração de nove pontos (100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,5, 0,25 μM).
- Calcule a equação de uma reta para AMP, ADO e INO: y = mx + b,
onde x é a concentração de μM e y corresponde à área do pico.
| Hora | Vazão (ml/min) | %A | %B |
| 1,00 | 100 | 0 |
| 1.24 | 1,00 | 100 | 0 |
| 6.22 | 1,00 | algarismo | 98 |
| 18.65 | 1,00 | algarismo | 98 |
Tabela 1: Método da coluna de equilíbrio. Representação esquemática das mudanças de solvente para o equilíbrio da coluna. Tampão A: acetato de amônio 7 mM, pH 3,0. Tampão B: acetonitrila.
| Hora | Vazão (ml/min) | %A | %B |
| 1,00 | 0 | 100 |
| 3,74 | 1,00 | 0 | 100 |
| 13.71 | 1,00 | 15 | 85 |
| 17.00 | 1,00 | 100 | 0 |
| 20.00 | 1,00 | 100 | 0 |
Tabela 2: Executar método de amostra. Representação esquemática das alterações de solventes para a medição por HPLC de compostos purinados. Tampão A: acetato de amônio 7 mM, pH 3,0. Tampão B: acetonitrila.
| Tempo de retenção | λmáximo |
| AMP | 8.00 min | 260 |
| Ino | 11.00 min | 260 |
| Ado | 11.90 min | 260 |
Tabela 3: Tempos de retenção de compostos purinas. Tempos de retenção típicos observados para AMP, ADO e INO. O detector UV é programado para ler a 260 nm.
4. Pré-tratamento com os Inibidores e Incubação com o Substrato (AMP)
- Para testar o consumo de AMP, a geração de ADO e INO sem inibição de CD73, ADA e transportadores de nucleosídeos, ressuspenda as células CLL purificadas 2 x 106 CD19 + / CD5 + em 250 μl de meio livre de soro e células de placa em uma placa de 48 poços (ou em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml).
- Adicionar 250 μl de AMP 400 μM ou inibidores de AMP plus para obter uma concentração final de 200 μM AMP. Incluir uma condição na ausência do substrato a utilizar como amostra em branco.
- Incubar de 30 a 60 min a 37 °C.
- No final do tempo de incubação, recolher 500 μl dos sobrenadantes em tubos de microcentrífuga frios (em gelo) e centrifugar imediatamente a 17.000 x g a 4 °C durante 5 min.
- Transferir os sobrenadantes para novos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e conservá-los imediatamente a -80 °C ou proceder à preparação da amostra para as séries de HPLC.
5. Preparação de amostras para HPLC
- Filtrar os sobrenadantes em novos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml com os filtros de seringa de 0,2 μm. Use seringas de 1 ml para filtrar.
- Se o sistema de HPLC for fornecido com um amostrador automático, prepare os frascos de vidro para HPLC e use as microinserções de 0,1 ml para pequenos volumes de amostra.
- Transfira pelo menos 100 μl de amostra para o frasco de vidro com uma micropipeta ou uma pipeta de vidro Pasteur. Tenha cuidado para transferir sem bolhas e feche o frasco com a tampa de rosca.
- As amostras estão agora prontas para análise por RP-HPLC.
6. Medições de purinas por HPLC
- Selecione o botão "executar amostras"; escolha "novo método de conjunto de amostras" no menu "arquivo".
- Selecione a opção "vazio" e indique: o número do frasco (no amostrador automático), o nome da amostra, o volume de injeção (50 μl).
- Selecione o método de coluna de equilíbrio e o método de execução de amostra descrito na Tabela 1 e na Tabela 2, respectivamente, para todas as execuções em branco e de amostra a seguir.
nota: Definir o método da coluna de equilíbrio (Tabela 1) antes de cada execução de amostra.
- Injectar 50 μl de branco (meio isento de soro) e de cada amostra.
- Determinar a concentração de purinas em cada amostra, quantificar o AMP, o ADO e o INO obtendo as áreas dos picos nos tempos de retenção descritos no quadro 3.
- Selecione o botão "processar" e, em seguida, a opção "integrar". Como alternativa, escolha manualmente os pontos inicial e final de cada pico para obter a medição da área. Isso é feito traçando uma linha entre os pontos inicial e final do pico.
- Determine a concentração de μM aplicando a equação obtida para a curva padrão: y = mx + b, onde x representa a concentração de μM e y é a área do pico medida a partir da amostra desconhecida.
NOTA: Um exemplo da curva padrão de calibração ADO é relatado na Figura 1, onde: x = (área y - 981,02)/40026
- Considerando que 2 x 106 células foram ressuspensas em 0,500 ml de meio, calcule os μmoles de AMP, ADO e INO consumidos e/ou produzidos por 106 células CLL aplicando a seguinte proporção:
μmoles: 1.000 ml = x μmoles: 0,250 ml
nota: Os μmoles em 1.000 ml (número de μmoles em 1 L) de são equivalentes à concentração de μM e x são os μmoles de nucleotídeo ou nucleosídeo produzidos por 106 células. Por fim, converta os μmoles em nmoles consumidos e/ou produzidos por 106 células CLL: nmoles = μmoles x 1.000
