Isolamento de células T-ALL marcadas com fluorescência: um método para isolar células T-ALL de peixe-zebra adulto

Resumo

Fonte: Pruitt, M. M., et al. Isolamento da População Lateral na Leucemia Linfoblástica Aguda de Células T Induzida por Myc em Peixe-Zebra. J. Vis. Exp. (2017).

Este protocolo descreve a técnica de isolamento de células T marcadas com fluorescência

Protocolo

1. Coleta de células T-ALL marcadas com fluorescência do peixe tumor primário

1. Prepare pelo menos 20 mL de soro fetal bovino inativado por calor a 10% em solução salina tamponada com fosfato 0,9x (FBS / PBS).
2. Adicione 1 mL de FBS / PBS a um frasco para injetáveis de sal de heparina sódica (300 unidades).
3. Selecione peixes com tumores em mais de 50% do corpo, ou aqueles peixes com dificuldade para comer ou nadar. Sacrifique os peixes com uma overdose de tricaína ou por imersão em água gelada. Confirme a morte por falta de movimento branquial e batimentos cardíacos.
4. Use uma lâmina de barbear para remover a cabeça do peixe.
5. Lave a cavidade do peixe com a solução de heparina para remover o excesso de glóbulos vermelhos.
   1. Usando uma pipeta, injete 100 μL de solução de heparina (adicione 1 mL de FBS / PBS a um frasco de sal de heparina sódica) na cavidade corporal do peixe. Remova todo o líquido derramado (ele conterá células sanguíneas) e pipete-o em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   2. Use uma nova ponta de pipeta para lavar o corpo novamente. Faça pelo menos três lavagens ou até que o líquido derramado pareça livre de sangue.
   3. Descarte todo o líquido das lavagens nessas etapas, pois ele não será usado em análises posteriores.
6. Colete as células de leucemia.
   1. Injete 100 μL de FBS / PBS na cavidade corporal do peixe.
   2. Aplique uma leve pressão na parte externa do corpo do peixe com a ponta da pipeta para espremer / empurrar para fora as células tumorais.
      nota: Se esta etapa for realizada usando um microscópio de dissecação, as células tumorais que saem da cavidade corporal serão evidentes.
   3. Colete o líquido e as células de cada lavagem em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   4. Repita as etapas 1.6.1-1.6.3 até que a maioria das células tumorais seja coletada (geralmente 5 a 10 vezes). Colete todas as células tumorais no mesmo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Mantenha as células em temperatura ambiente.
7. Misture as células tumorais coletadas da etapa anterior, pipetando-as suavemente para dissociar os aglomerados de células. Filtrar a suspensão celular através de um filtro de malha de 40 μm. Lave o filtro 1-2 vezes com 100 μL de FBS/PBS. Mantenha as células em temperatura ambiente.
8. Misture 2 μL de suspensão celular com 18 μL de azul de tripano (0,4%, diluído 1:10 e filtrado) em um novo tubo. Carregue 10 μL em um hemocitômetro e conte o número de células fluorescentes vivas (não azuis) para calcular o número de células tumorais isoladas.
   nota: As células GFP negativas não azuis são provavelmente células T normais e não malignas e não devem ser contadas. Pelo menos 2 x 10⁶ células são necessárias para corar as células com Hoechst 33342.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Peixe-zebra singênico (CG2)			Ver Mizgireuv et al., 2006
RAG2:plasmídeo C-MYC			Laboratório Langenau
rag2: plasmídeo GFP construído no Laboratório de Jong			promotor rag2 do Laboratório Langenau
plasmídeo pCS2-transposase			Laboratório Chien
Microscópio SteREO Discovery V8	Microscopia Carl Zeiss	Rolamento 495015-0008-000
Metanossulfonato de tricaína (MS-222)	Química Ocidental, Inc	Fisher Scientific - NC0342409	100 gramas
Soro fetal bovino (FBS)	Laboratórios HyClone, Inc.	Fisher Scientific - SH3007103	500 mL
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Gibco da Life Technologies	1001-023	pH 7,4 (1x) - 500 mL
Sal de heparina sódica	Sigma-Aldrich	2106	Frascos de 15 a 300 unidades
Filtro de malha de 40 μm	Marca Falcon Corning	Rolamento 352340	Caixa de 50
Azul de tripano	Sigma Ciências da Vida	T8154	20 mL - Solução (0,4%)