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1. Coloração das células T-ALL marcadas com fluorescência com Hoechst 33342 para identificar a população lateral
- Diluir Hoechst 33342 1:10 com H2O livre de nuclease para fazer a concentração de trabalho de 1 mg/ml. Armazene o corante a 4 °C e no escuro.
- Prepare uma solução 100 mM de verapamil dissolvendo 49,1 mg em 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO).
nota: O verapamil é um inibidor de transportadores ABC e é um controle importante para experimentos de populações secundárias. A adição de verapamil às amostras inibirá a capacidade dos transportadores ABC de efluir o corante Hoechst 33342. Portanto, uma população do lado verdadeiro desaparecerá quando o verapamil for adicionado à amostra.
- Defina um banho-maria para 28 °C.
- Prepare amostras e controles no escuro, adicionando células e soluções aos tubos classificadores de células ativadas por fluorescência (FACS).
- Prepare as amostras adicionando 106 células, 15 μL de 1 mg / mL Hoechst 33342 e 2,5 μL de DMSO a um tubo FACS. Ajuste o volume para 1 mL com FBS/PBS.
- Prepare os controles adicionando 106 células, 15 μL de 1 mg / mL Hoechst 33342 e 2,5 μL de 100 mM de verapamil a um tubo FACS. Ajuste o volume para 1 mL com FBS/PBS.
nota: Recomenda-se um mínimo de 106 células/amostra, mas é preferível corar mais células, especialmente se as células da população lateral forem classificadas para análise posterior. Não exceda 106 células/mL e mantenha a concentração Hoechst 33342 em 15 μg/mL. Se 10 x 106 células forem coradas, o volume total da reação é de 10 mL.
- Incubar em banho-maria a 28 °C no escuro durante 120 min.
- Após a incubação, coloque as células imediatamente no gelo e mantenha-as no escuro.
- Pulverizar as células a 4 °C durante 6 min a 300 x g. Remover o sobrenadante. Lave com 1 mL de FBS / PBS.
- Pulverizar as células a 4 °C durante 6 min a 300 x g. Remover o sobrenadante. Ressuspenda as células em 1 mL de FBS / PBS.
- Conservar a 4 °C até à separação das células.
- 15 min antes da classificação das células, adicione 2 μL de estoque de iodeto de propídio (PI) (1 mg / mL) a cada 1 mL de FBS / PBS (concentração final: 2 μg / mL). Misture bem.
2. Use o FACS para encontrar a população lateral dentro da população de células T-ALL marcadas com fluorescência
- Analise as suspensões de células T-ALL de peixe-zebra coradas em um classificador de células equipado com um laser UV para excitação de corante Hoechst 33342 e um laser de 488 nm para excitação de PI e para a detecção das células GFP+ T-ALL.