Ensaio de População Lateral: Um Método para Isolar a População Lateral de Células Tumorais de Peixe-Zebra

Resumo

Fonte: Pruitt, M. M., et al. Isolamento da População Lateral na Leucemia Linfoblástica Aguda de Células T Induzida por Myc em Peixe-Zebra. J. Vis. Exp. (2017).

O protocolo a seguir descreve um método para isolar a população lateral de células T de células T A população secundária carece de marcadores celulares proeminentes e, portanto, usamos o ensaio de efluxo de corante Hoechst 33342 para isolá-los.

Protocolo

1. Coloração das células T-ALL marcadas com fluorescência com Hoechst 33342 para identificar a população lateral

1. Diluir Hoechst 33342 1:10 com H₂O livre de nuclease para fazer a concentração de trabalho de 1 mg/ml. Armazene o corante a 4 °C e no escuro.
2. Prepare uma solução 100 mM de verapamil dissolvendo 49,1 mg em 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO).
   nota: O verapamil é um inibidor de transportadores ABC e é um controle importante para experimentos de populações secundárias. A adição de verapamil às amostras inibirá a capacidade dos transportadores ABC de efluir o corante Hoechst 33342. Portanto, uma população do lado verdadeiro desaparecerá quando o verapamil for adicionado à amostra.
3. Defina um banho-maria para 28 °C.
4. Prepare amostras e controles no escuro, adicionando células e soluções aos tubos classificadores de células ativadas por fluorescência (FACS).
   1. Prepare as amostras adicionando 10⁶ células, 15 μL de 1 mg / mL Hoechst 33342 e 2,5 μL de DMSO a um tubo FACS. Ajuste o volume para 1 mL com FBS/PBS.
   2. Prepare os controles adicionando 10⁶ células, 15 μL de 1 mg / mL Hoechst 33342 e 2,5 μL de 100 mM de verapamil a um tubo FACS. Ajuste o volume para 1 mL com FBS/PBS.
      nota: Recomenda-se um mínimo de 10⁶ células/amostra, mas é preferível corar mais células, especialmente se as células da população lateral forem classificadas para análise posterior. Não exceda 10⁶ células/mL e mantenha a concentração Hoechst 33342 em 15 μg/mL. Se 10 x 10⁶ células forem coradas, o volume total da reação é de 10 mL.
5. Incubar em banho-maria a 28 °C no escuro durante 120 min.
6. Após a incubação, coloque as células imediatamente no gelo e mantenha-as no escuro.
7. Pulverizar as células a 4 °C durante 6 min a 300 x g. Remover o sobrenadante. Lave com 1 mL de FBS / PBS.
8. Pulverizar as células a 4 °C durante 6 min a 300 x g. Remover o sobrenadante. Ressuspenda as células em 1 mL de FBS / PBS.
9. Conservar a 4 °C até à separação das células.
10. 15 min antes da classificação das células, adicione 2 μL de estoque de iodeto de propídio (PI) (1 mg / mL) a cada 1 mL de FBS / PBS (concentração final: 2 μg / mL). Misture bem.

2. Use o FACS para encontrar a população lateral dentro da população de células T-ALL marcadas com fluorescência

1. Analise as suspensões de células T-ALL de peixe-zebra coradas em um classificador de células equipado com um laser UV para excitação de corante Hoechst 33342 e um laser de 488 nm para excitação de PI e para a detecção das células GFP+ T-ALL.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Soro fetal bovino (FBS)	Laboratórios HyClone, Inc.	Fisher Scientific - SH3007103	500 mL
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Gibco da Life Technologies	1001-023	pH 7,4 (1x) - 500 mL
Hoechst 33342	Tecnologias da Vida	H3570	10 mL
Verapamil	Sigma Ciências da Vida	V4629	1 g
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma Ciências da Vida	D8418	100 mL
Iodeto de propídio	Tecnologias da Vida	Pág. 3566	10 mL
Classificador de células FACSAria Fusion	BD Biociências