1. Isolamento de neurônios
Uma vez terminada a coleta do extrato/sobrenadante, continue com o isolamento dos neurônios.
- Para neurônios DRG, colete o DRG cervical a lombar de ratos recém-nascidos entre o dia pós-natal (P) 2-12 após a decapitação e dissecção estereomicroscópica do DRG (Figura 1A). Para ter neurônios DRG suficientes para uma placa de 24 poços, colete todos os DRG cervicais a lombares de um rato recém-nascido (igual a 52 DRG) por placa.
- Corte as projeções periféricas (neurais) e centrais (raízes) do DRG por meio de microtesouras. Deixar as projeções no lugar impede a trituração e aumenta o risco de contaminação da cultura por fibroblastos.
- Para neurônios MP, corte o mesentério do intestino delgado e remova manual e cuidadosamente a camada seromuscular do intestino delgado (para um protocolo detalhado sobre isolamento de MP, Figura 1B). Para MP, colete o plexo de dois ratos por placa de 24 poços.
nota: Tente ser o mais gentil possível para evitar lágrimas na camada seromuscular, pois impedem sua separação bem-sucedida do intestino delgado.
- Colete o DRG e a camada seromuscular em meio essencial mínimo gelado (MEM) fornecido com gentamicina (20 mg em meio de 500 ml) e metronidazol (2,5 mg em meio de 500 ml).
- Após a coleta de DRG, incube-os em Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) fornecido com colagenase Tipo II por 20-30 min. Para isolamento de MP, incubar no tipo colagenase entre 1-3 horas, dependendo da idade do animal (Figura 1C).
- Para MP, colete as peças de MP em forma de rede sob um estereomicroscópio e transfira para MEM gelado.
- Em seguida, triturar o DRG e o MP por meio de seringas de diâmetro decrescente.
nota: A trituração excessiva pode destruir os neurônios, mas menos as células gliais.
- Uma vez que o meio contendo o DRG ou MP tenha ficado turvo, centrifugue a suspensão a 93,9 x g por 5 min, descarte o meio e ressuspenda em meio neurobasal (suplementado com 100 U / ml de penicilina, 100 μg / ml de estreptomicina, 0,5mM de L-glutamina e 2% de B-27).
- Conte o número total de células (ou seja, neurônios E glia) por meio de um hemocitômetro.
nota: O número de células necessárias depende do parâmetro de medição. Para a quantificação da densidade de neuritos, são necessárias culturas mais densas e, portanto, um número maior de células do que para a medição do crescimento de neuritos, tamanho pericarional e padrão de ramificação de neurônios individuais. Para medições de densidade de neuritos, use, por exemplo, 10.000 células (neurônio + glia) / poço ou 1.500 neurônios / poço. Para morfometria em neurônios individuais, recomenda-se tripsinização breve (1 minuto de duração) de células e semeadura de 2.500 células/poço ou 400 neurônios/poço. O rendimento típico de células obtidas de um rato é de cerca de 300.000-500.000 células.
- Semeie as células em lamínulas de 13 mm que foram revestidas na noite anterior e cubra os poços com meio neurobasal (suplementado com 100 U / ml de penicilina, 100 μg / ml de estreptomicina, 0,5 mM de L-glutamina e 2% de B-27) (Figura 1D).
nota: Use lamínulas revestidas com poli-D-lisina (40 mg / m2) OU lamínulas revestidas com ornitina e laminina (1 mg / ml cada). As células se ligam à poli-D-lisina extremamente rápido, tornando-a adequada para experimentos nos quais muitas células são necessárias (ou seja, medições de densidade de neuritos). A ligação à laminina é em geral um pouco mais fraca, mas a laminina é um forte promotor do crescimento de neuritos. Portanto, para medições de ramificação neuronal e comprimento de neuritos, prefira o revestimento de ornitina / laminina.
- Deixe as células se ligarem aos poços durante a noite. No dia seguinte, preparar o meio suplementado com extracto (a uma concentração final de extracto/sobrenadante de 100 μg/ml).
- Aspirar o meio de semeadura e realizar uma lavagem opcional muito suave com PBS e, em seguida, pipetar lentamente o meio suplementado com extrato/sobrenadante (Figura 1E).
- Deixe as células crescerem por 48 horas. Aspire o meio e fixe em paraformaldeído a 4% para imunocoloração (Figura 1F).
- Realize a coloração de imunofluorescência dupla usando marcadores específicos para neurônios (por exemplo, beta III-tubulina) e específicos para glia (por exemplo, proteína ácida fibrilar glial / GFAP) (Figura 1G).
- Para morfometria, use um microscópio de luz invertida equipado com uma câmera CCD em combinação com software automatizado que permite a medição da densidade de neuritos (ver Tabela).
- A densidade de neuritos de culturas neuronais é medida em 4-5 fotomicrografias representativas com ampliação de 200x de 4 regiões diferentes de crescimento mais denso em cada lamínula, sobrepondo uma grade de 50 μm x 50 μm e contando a densidade de fibras por quadrado medida nas fibras que se cruzam. O crescimento de neuritos, o número médio de ramos por neurônio, o comprimento médio do ramo e o tamanho pericarional podem ser medidos a partir de 30 neurônios solitários selecionados aleatoriamente de cada lamínula, marcando os neuritos e pericarias (Figura 1H).
