Este artigo descreve um protocolo para isolamento e manutenção de culturas de fibroblastos primários da pele e do tecido pulmonar dos roedores silvestres.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Estabelecer culturas de fibroblastos adultos primária de roedores
Neste artigo
Resumo
Resumo
A importância de usar pilhas, ao invés de linhas celulares de cancro, para estudos biológicos está se tornando amplamente reconhecida. Pilhas são preferidas em estudos de células a apoptose ciclo de controle, e reparo do DNA, como as células cancerosas carregam mutações em genes envolvidos nestes processos. Pilhas não podem ser cultivadas indefinidamente devido ao início da senescência replicativa ou aneuploidization. Assim, novas culturas devem ser estabelecidas regularmente. O procedimento para o isolamento de fibroblastos de roedores embrionárias está bem estabelecida, mas isolar culturas de fibroblastos adultos, muitas vezes representa um desafio. Fibroblastos de roedores adultos isolados a partir de modelos do rato da doença humana pode ser um controle preferidos quando comparando-os com fibroblastos de pacientes humanos. Além disso, os fibroblastos adultos são o único material disponível quando se trabalha com roedores silvestres onde as fêmeas grávidas não podem ser facilmente obtidos. Aqui nós fornecemos um protocolo para isolamento e cultura de fibroblastos da pele de roedores adultos e os pulmões. Nós usamos este procedimento com sucesso para isolar os fibroblastos de mais de vinte espécies de roedores a partir de ratos de laboratório e em ratos de roedores silvestres como o castor, porco-espinho, e esquilo.
Protocolo
1. Antes de Começar
- Esterilizar a tesoura e uma pinça com etanol 70%.
- Lugar agitador magnético pequeno dentro de um copo 30 mL, cobrir com duas camadas de papel alumínio, e autoclave.
- Prepare a 28 unidades Wunsch / mL solução estoque de Liberase Blendzyme 3 em água estéril. Faça alíquotas 0,5 mL e congelar a -20 ° C. Descongelar uma alíquota de novo antes de cada utilização. A solução pode parecer turvo após o descongelamento. Vortex a solução até que fique claro.
- Aqueça o meio de cultura celular.
2. Preparação de amostras de animais
Cuidado: animai....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Fibroblastos normais primárias oferecem uma excelente alternativa para as linhas de células de câncer estabelecido na pesquisa biológica. Uma vantagem importante de fibroblastos é que eles não carregam mutações em oncogenes e supressores de tumor e manter postos de controle do ciclo celular intacto. Isso faz com que fibroblastos normais de um sistema preferido para os estudos de regulação do ciclo celular, reparo do DNA e apoptose. O protocolo aqui descrito fornece uma receita simples para o isolamento e manutenção de f.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Steven Austad para fornecer-nos com a primeira versão do presente protocolo. Este trabalho foi financiado por concessões do NIH e da Ellison Medical Foundation para VG e AS
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Meio DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-032 | |
| Soro bovino fetal (SBF), qualificado | Invitrogen | 01437-036 | O soro qualificado foi pré-testado para fornecer bom suporte de crescimento para fibroblastos primários. |
| Antibiótico/antimicótico | Invitrogen | 15420-096 | |
| Penicilina/estreptomicina | Invitrogen | 15140-122 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05401127001 | Enzima substituta. |
| Nota dos autores: desde que a Roche descontinuou o Liberase Blendzyme 3 (11814184001), eles recomendam o uso do Liberase TM Research Grade com termolisina média (n.º do cat. 05401119001 - 10 mg, n.º do cat. 05401127001 - 100 mg) como alternativa. Mudamos com sucesso para esta enzima sem problemas. | |||
| Meio EMEM | ATCC | 30-203 | O meio EMEM da ATCC já contém aminoácidos não essenciais e piruvato de sódio. |
| Bisturi descartável estéril #21 com penas | Múltiplos fornecedores | ||
| Incubadora de controle de três gases | Forma ou Heraeus |
Referências
- Seluanov, A. Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging . Cell. 7, 813-823 (2008).
- Parrinello, S. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
