Ensaio de fosfatase em células CRC: um método para examinar o estado de fosforilação da proteína Tau em células de câncer colorretal

Resumo

Fonte: Huda, M. N., et al. Ensaio para fosforilação e ligação de microtúbulos junto com localização da proteína Tau em células de câncer colorretal. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo descreve um protocolo para avaliar o estado de fosforilação da proteína tau por um ensaio de fosfatase em células de câncer colorretal. A enzima fosfatase atua nos grupos fosfato presentes na proteína tau, aumentando a mobilidade da proteína tau no gel SDS PAGE em comparação com as amostras de proteína tau não tratadas.

Protocolo

1. Ensaio de fosfatase

1. Trate os lisados celulares quando as células atingirem ~ 65% de confluência (aproximado usando microscopia), remova o meio suplementado com MEM e adicione MEM sem soro com curcumina de 5 μM, 10 μM e 30 μM ou LiCl de 25 mM, 50 mM e 100 mM. Incubar a 37 °C durante 24 h numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO₂, 24 h após o tratamento, lavar as células com 1 ml de solução salina tamponada com fosfato gelado (PBS) e raspar as células utilizando um raspador de células. Transfira as células raspadas para tubos de centrífuga de 1,5 mL e centrifugue por 4 min a 1.800 x g a 4 ° C para obter pellets de células. Lisar as células suspendendo os pellets em 100 μL de tampão RIPA completo a 4 ° C por 20 min enquanto bate regularmente nos tubos. Sonicar as amostras brevemente. Centrifugue os homogeneizados de células em uma centrífuga de bancada a 22,570 x g por 20 min a 4 ° C. Transfira os sobrenadantes para outros tubos marcados usando uma pipeta) com fosfatase alcalina no tampão de fosfatase alcalina.
   1. Para amostras de controlo e tratadas, preparar amostras de 20 μL contendo 20 μg de proteína total. Adicione o volume de lisados celulares que contém 20 μg de proteína total, seguido por 2 μL de tampão fosfatase alcalina e 10 μL de fosfatase alcalina. Adicione água destilada para perfazer 20 μL.
2. Incubar as amostras a 37 °C durante 1 h. Interromper a reacção adicionando ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a uma concentração final de 50 mM ou adicionando ortovanadato de sódio (Na₃VO₄) a uma concentração final de 10 mM. A reação também pode ser interrompida aquecendo a 75 °C por 5 min.
3. Antes da incubação de amostras com acabamento de fosfatase, preparar amostras da mesma concentração sem adição de fosfatase para comparação com amostras tratadas com fosfatase.
4. Adicione o buffer de carregamento de gel 4X SDS recém-preparado contendo 400 mM DTT.
5. Incubar as amostras num bloco de calor a 100 °C durante 5 min. Misturar as amostras utilizando um vórtice. Deixe esfriar em temperatura ambiente por ~ 10-15 min.
6. Monte um sistema de eletroforese para executar um gel de poliacrilamida a 10% por SDS-PAGE.
   1. Carregue 10 μg de proteína (amostra de 13 μL) por alvéolo em um gel de poliacrilamida a 10%. Carregue a escada de peso molecular.
   2. Depois de carregar a amostra, conecte os eletrodos positivo e negativo do sistema de eletroforese a uma fonte de energia para manter uma tensão constante. Inicialmente, comece em 70 V por 20 min para mover as amostras de proteína do gel de empilhamento para o gel de resolução. Em seguida, aumente a voltagem para 125 V e deixe o gel funcionar por aproximadamente 70-120 min até que as amostras e a escada de proteínas cheguem ao final do gel.
   3. Após a conclusão da eletroforese, transfira o gel para uma membrana de PVDF usando um sistema de eletroblotting úmido. Transfira por ~ 100 min a 100 V.
   4. Marque a mancha fazendo um pequeno corte na lateral da escada de peso molecular. Use uma folha de plástico transparente e um cortador afiado para cortar a mancha.
7. Bloqueie a membrana em um tampão de bloqueio BSA a 4% por 90 min em temperatura ambiente.
8. Incubar o blot em solução de anticorpo primário (anti-tau a 1:5.000) a 4 °C durante a noite. Lave a mancha em PBST quatro vezes, por 7 min cada.
9. Prepare a solução de anticorpo secundário relevante (IgG anti-camundongo de cabra a 1:5.000) e incube o blot por 90 min em temperatura ambiente. Lave em PBST quatro vezes, por 7 min cada.
10. Desenvolva o blot usando um kit de quimioluminescência de acordo com as recomendações do fabricante. Cubra a mancha com filme plástico transparente. Adquira imagens por um sistema de imagem de quimioluminescência para quimioluminescência com software relevante.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Célula HCT 116	ATCC	CCL-247
Prato de 100 mm	Corning	430161
MEM (EBSS)	Hyclone	SH30024.01
Soro fetal bovino (FBS)	ThermoFisher (Gibco)	16000044	Armazenar a -20 °C
Anticorpo anti-Tau 13	Abcam	AB19030
Ditiotreitol (TDT)	Roche	10 708 984 001	Temperatura de armazenamento 2–8 °C
Curcumina	Sigma-Aldrich (Fluka)	Nº 78246	Temperatura de armazenamento 2–8 °C
Anticorpo anti-Tau (fosfo S396)	abcam	AB109390
Fosfatase alcalina termossensível FastAP	Thermo Científico	EF0651	Armazenar a -20 °C
PMSF	sigma	Pág. 7626	Armazene em temperatura ambiente
Coquetel Inibidor de Fosfatase	Sinalização celular	5870	Conservar a 4 °C
Coquetel de inibidores de protease	Sinalização celular	Rolamento 5871	Conservar a 4 °C
Anticorpo secundário de IgG de cabra anti-camundongo	ThermoFisher	A-11005	Conservar a 4 °C no escuro
Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)	Affymetrix	Rolamento 75819
Gerador de imagens moleculares	Bio-Rad	ChemiDoc XRS+	Conservar a 4 °C
Tampão RIPA	sigma	R 0278	Temperatura de armazenamento 2–8 °C
Tritão X-100	Sigma-Aldrich	X - 100	Conservar a cerca de 25 °C
Membrana em PVDF	Bio-Rad	Rolamento 162-0177
Anticorpo secundário de IgG de cabra anti-camundongo	ThermoFisher	A-11005	Conservar a 4 °C no escuro
Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)	Affymetrix	Rolamento 75819
Reagente de corante de ensaio de proteína	Bio-Rad	500-0006
Desmembrador Sônico	Fisher Científico	Modelo 500
Centrífugas de microlitros	Hettich Zentrifugen	MIKRO 200 R