Este protocolo descreve como imunoprecipitação da cromatina (chip) é usado para estudar as alterações dinâmicas ao modelo de cromatina que regulam a transcrição induzida por uma via de transdução de sinal.
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Artigo de método
Cromatina imunoprecipitação (chips) para a Modificação do ensaio dinâmico Histone na expressão dos genes ativados em células humanas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Em resposta a uma variedade de ligantes extracelulares, o STAT (transdutor de sinal e ativador de transcrição) fatores de transcrição são rapidamente recrutados a partir de seu estado latente no citoplasma aos receptores da superfície celular, onde elas são ativadas por fosforilação de um resíduo de tirosina único 1. Eles, então, dimerizam e translocar para o núcleo de dirigir a transcrição de genes-alvo, afetando o crescimento, diferenciação homeostase, e da resposta imune. Não é de surpreender, dado o seu envolvimento generalizado nos processos celulares normais, desregulação da função STAT contribui para a doença humana, especialmente para cânceres 2 e doenças auto-imunes 3.
Está bem estabelecido que a transcrição é regulada por alterações ao modelo de cromatina 4,5. Essas alterações incluem as atividades de ATP-dependente complexos, bem como modificações covalentes das histonas e metilação do DNA 6. , Pois a ativação STAT da expressão do gene é rápida e transitória, que requer mecanismos específicos para o modelo modular a cromatina em loci STAT-dependente gene. Para definir esses mecanismos, caracterizamos as modificações das histonas e as atividades enzimáticas que gerá-los em loci de genes que respondem a STAT sinalização. Este protocolo descreve imunoprecipitação da cromatina, um método que é valioso para o estudo de sinalização para STAT cromatina na expressão dos genes ativados.
Protocolo
PLANEJAMENTO
Um dia antes de um experimento ChIP está prevista, as células devem ser cultivadas para que um número suficiente disponível. Suponha que cada ensaio ChIP exigirá ~ 1-1,5 x 10 7 células. Sempre planeje fazer ambos os controles negativo (IgG) e positivo (anticorpo pan histona) e as experiências duplicadas.
Dica - Para as células 2FTGH, cada ensaio ChIP requer cerca de 15 centímetros um prato de cultura de tecidos em 80% confluência.
PARTE 1: PREPARE cromatina e PERFORM ChIP
- Remova a mídia de cultura e induzir as células para os tempos necessários com 20 mL d....
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Discussão
O protocolo descrito ChIP tem sido usado com sucesso em laboratório para ensaio de mais de vinte diferentes modificações das histonas. Além disso, têm caracterizado as mudanças na ocupação de fatores de transcrição, histonas modificando-enzimas, proteínas que reconhecem modificações das histonas eo RNA polimerase II maquinaria de transcrição, em vários IFN-γ genes induzidos. Temos também o procedimento utilizado para caracterizar as mudanças em modificações das histonas durante a diferenciação de células-tronco de um câ.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado pela Universidade de Virginia, a Universidade de Virginia Cancer Center e The Thomas F. Miller e Kate Jeffress Memorial Trust. Agradecemos ao James E. Darnell Lab (Rockefeller University), a Robert Ross Lab (Fordham University) para linhas de celular.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Formaldeído 37% | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Clorofórmio/álcool isoamílico | Acros Organics | AC32715-5000 | |
| Inibidores Completos de Protease Mini | Roche Group | 1836153 | |
| Soro de Bezerro Cósmico | Hyclone | SH30087.04N | |
| DMEM | Hyclone | SH30243 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Etanol | Pharmco Products, Inc. | zp1110EP | |
| Glicina | Roche Group | 100149 | |
| Glicogênio | Roche Group | 901393 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| IFN-gama | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| IgG | Jackson ImmunoResearch | 109-005-003 | |
| KCl | MP Biomedicals | ||
| LiCl | Sigma-Aldrich | L4408 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Acetato de Sódio | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Sal de Ácido Desoxicólico de Sódio | Fisher Scientific | BP349-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| NP40 | US Biological | N3500 | |
| Anti-Histona H3, CT, pan | EMD Millipore | 07-690 | |
| Fenol/clorofórmio/isoamílico | Fisher Scientific | 108-95-2 | |
| Solução Salina Tamponada com Fosfato | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| PMSF | EMD Millipore | 50-230-0316 | |
| Proteinase K | 5 PRIME | 2500140 | |
| RNase A | 5 PRIME | 2500130 | |
| Agarose de DNA de Esperma de Salmão/Proteína A | EMD Millipore | 16-157 | |
| Agarose de DNA de Esperma de Salmão/Proteína G | EMD Millipore | 16-201 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327372500 | |
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| Anti-STAT1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-345X | |
| Anti-RNA Polimerase II | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-899 |
Referências
- Levy, D., Darnell, J. E. Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).
- Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr The role of STATs in transcriptional control and their impact on ....
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Reimpressões e permissões
