Análise de Expressão Gênica Utilizando bacteriana Microarrays

Protocol

Reação reversa Transcriptase

Vire bloco de aquecimento a 70-80 ° C e 42 ° C. Banhos de água também pode ser usado nesta etapa. Se estiver usando blocos de aquecimento, coloque um pouco de água para que o calor é uniforme.

1. Reação priming
   1. Tome 3 mg de RNA
   2. Ajustar o volume para 13 mL com água livre de RNase
   3. Adicionar 2,5 mL de aleatório hexâmero primers (2mg/ml)
2. Misturar bem e incubar a 70-80 ° C por 8 minutos. Em seguida, coloque, em gelo por 5 min.
3. Prepare RT cocktail (14,5 mL / rxn):
   
   

   Componente

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AA-dUTP		Sigma-Aldrich	A0410	5-(3-aminoalil)-2' desoxiuridina-5'-trifosfato
dNTP		Amersham	27-2035-01	100 mM dNTP Conjunto PCR
grau Random Hexamer primers		Amersham	27-2166-01	3mg/mL
SuperScript III RT		Invitrogen	80800444	200U/μ L
CyDye™		Amersham	RPN5661	Pacote de Corante Reativo Pós-Rotulagem
QIAquick		Qiagen	28104	Kit de purificação PCR
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4	Tampão			Para fazer um tampão fosfato 1M (KPO4, pH 8,5-8,7) combine: 9,5 mL 1M K2HPO4 e 0,5 ml 1M KH2PO4
Tampão de lavagem de fosfato	Tampão			Para 100 mL Tampão de lavagem de fosfato (5 mM KPO4, pH 8,0, 80% EtOH) misturar: 0,5 ml 1 M KPO4 pH 8,5 + 15,25 mL MilliQ água + 84,25 mL 95% de etanol. O tampão de lavagem ficará ligeiramente turvo.** IMPORTANTE: O tampão de lavagem de fosfato deve ser preparado diariamente.
Tampão de eluição de fosfato	Tampão			Diluindo 1 M KPO4, pH 8,5 a 4 mM com água estéril
Tampão				(Na2CO3): 0,5M, pH 9,0. Dissolva 4,2 g de NaHCO3 em 80 mL de água estéril e ajuste o pH para 9,0 com 10 N NaOH; aumente o volume para 100 mL com água estéril. Para fazer uma solução de 50 mM para a reação de acoplamento do corante, diluir 1:10 com água. Nota: O tampão de carbonato muda a composição ao longo do tempo; Faça-o fresco a cada duas semanas a um mês.