Análise de Expressão Gênica Utilizando bacteriana Microarrays

Protocolo

Reação reversa Transcriptase

Vire bloco de aquecimento a 70-80 ° C e 42 ° C. Banhos de água também pode ser usado nesta etapa. Se estiver usando blocos de aquecimento, coloque um pouco de água para que o calor é uniforme.

1. Reação priming
   1. Tome 3 mg de RNA
   2. Ajustar o volume para 13 mL com água livre de RNase
   3. Adicionar 2,5 mL de aleatório hexâmero primers (2mg/ml)
2. Misturar bem e incubar a 70-80 ° C por 8 minutos. Em seguida, coloque, em gelo por 5 min.
3. Prepare RT cocktail (14,5 mL / rxn):
   
   

   Componente

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
AA-dUTP		Sigma-Aldrich	A0410	5-(3-aminoalil)-2’desoxiuridina-5’trifosfato
dNTP		Amersham	27-2035-01	Conjunto de dNTP 100 mM, grau PCR
Primeres hexaméricos aleatórios		Amersham	27-2166-01	3 mg/mL
SuperScript III RT		Invitrogen	80800444	200 U/μL
CyDye™		Amersham	RPN5661	Pacote de corante reativo pós-marcação
QIAquick		Qiagen	28104	Kit de purificação de PCR
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4	Tampão			Para preparar um tampão fosfato 1 M (KPO4, pH 8,5–8,7), misture: 9,5 mL de K2HPO4 1 M e 0,5 mL de KH2PO4 1 M
Tampão de lavagem fosfato	Tampão			Para 100 mL de tampão de lavagem fosfato (5 mM KPO4, pH 8,0, 80% EtOH), misture: 0,5 mL de KPO4 1 M, pH 8,5 + 15,25 mL de água MilliQ + 84,25 mL de etanol a 95%. O tampão de lavagem ficará levemente turvo. **IMPORTANTE: o tampão de lavagem fosfato deve ser preparado diariamente.
Tampão de eluição fosfato	Tampão			Diluir o KPO4 1 M, pH 8,5 até 4 mM com água estéril
Tampão de carbonato de sódio				(Na2CO3): 0,5 M, pH 9,0. Dissolva 4,2 g de NaHCO3 em 80 mL de água estéril e ajuste o pH para 9,0 com NaOH 10 N; complete o volume para 100 mL com água estéril. Para preparar uma solução 50 mM para a reação de acoplamento do corante, dilua 1:10 com água. Observação: o tampão de carbonato altera sua composição ao longo do tempo; prepare-o fresco a cada duas semanas ou mês.