A fim de examinar a expressão gênica no tecido da asa pupal de Bicyclus anynana, apresentamos um protocolo otimizado para em hibridizações in situ usando riboprobes. Nós também fornecemos diretrizes para a otimização deste protocolo para o uso em asas pupal das espécies de Lepidoptera outros.
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Artigo de método
No Protocolo situ de asas da borboleta Pupal Usando Riboprobes
Neste artigo
Resumo
Resumo
Apresentamos aqui, em formato de vídeo, um protocolo para a hibridizações in situ nas asas pupal do Bicyclus borboleta anynana usando riboprobes. Em hibridizações in situ, um dos pilares da biologia do desenvolvimento, são úteis para estudar os padrões espaciais e temporais da expressão gênica no desenvolvimento de tecidos ao nível da transcrição. Se os anticorpos que alvejam os produtos de proteína de transcrição de genes ainda não foram desenvolvidos, e / ou existem múltiplas cópias do gene de uma proteína específica no genoma que não podem ser diferenciados utilizando anticorpos disponíveis, em situs pode ser usado em seu lugar. Enquanto um in situ para discos asa larval tem sido disponibilizados para a comunidade de borboletas por vários anos, o atual protocolo foi optimizado para as asas maiores e mais frágeis pupal.
Protocolo
DIA 1
- Prepare as seguintes soluções:
- PBS 10x
- 1x PBS
- 1x PBT
- 2 O DDH
- Adicionar DEPC 0,1% para volume total e agitar soluções vigorosamente.
- Autoclave.
- Fix paraformaldeído 4% - usando PBS-DEPC
- Proteinase K solução - se precipitar está presente vortex, vigorosamente antes de retirar alíquota
- Tampão de digestão Parar
- Tampão Prehybridization
- 50:50 PBT: Buffer Prehybridization
- Tampão de hibridização
- Soluções devem ser mantidos RNase-free. Use um vidro-ware que foi cozido (4 horas a 250 ° C) ou de plástico descartáveis. Pipetas sorológicas são muito úteis para a fabricação de soluções
- Dissecar as asas do tempo-encenado pupas em PBS
- Mover as asas diretamente para Fix tampão em poços de 24 placa de cultura bem à temperatura ambiente
- Fix discos por 2 horas
- Lavar 5 x 5 minutos em PBT
- Incubar as asas durante 3 minutos em solução de Proteinase K
- Enxágüe 2 x em Tampão Parar Digestão
- Lavar 5 x 5 minutos em PBT
- Lave 2 x 5 minutos em 50:50 PBT: PHB
- Lavar 1 x 10 minutos em PHB
- Incubar em PHB pelo menos 1 hora a 55 ° C.
- Calor desnaturam RNA sonda (20-50ng necessários por poço) (80 ° C por 5 minutos) e adicione a tampão de hibridação (100 l necessária por poço)
- Adicionar sonda para os poços e incubar 48 horas a 55 ° C
DIA 3
- Lavar 4 x 5 minutos em 55 ° C PHB
- Incubar durante a noite em PHB, a 55 ° C
DIA 4
- Prepare as seguintes soluções:
- Buffer do bloco de anticorpos
- Lavar 1 x 5 minutos em 50:50 PBT: PHB
- Lavar 4 x 5 minutos em PBT
- Asas incubar por 1 hora em buffer do bloco a 4 ° C
- Incubar as asas em uma diluição 1:2000 do anticorpo anti-Dig overnight a 4 ° C
DIA 5
- Prepare seguintes soluções:
- Tampão de detecção
- Solução em desenvolvimento - (embrulhe em papel alumínio) sensível à luz
- Lavar 3 x 5 minutos em PBT em temperatura ambiente
- Lave 7 x 5 minutos em PBT
- Enxágüe asas duas vezes em tampão de Detecção
- Desenvolver asas em 1 ml de Desenvolvimento de Solução - tempo de desenvolvimento deve ser monitorada a cada vez - vezes em desenvolvimento podem mudar até mesmo quando se utiliza as mesmas sondas e solução em desenvolvimento - em geral, verificação após 5-10 minutos e depois aumentar os intervalos até durante a noite. Placa deve ser envolto em papel alumínio para evitar exposição à luz, quando não verificar amostras.
- Enxágüe cinco vezes em Tampão parar de desenvolver
- Monte asas.
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Discussão
Otimização dos protocolos existentes
Em hibridizações in situ em discos asa larval foram realizados com sucesso usando os discos de borboletas Precis coenia (Carroll et al, 1994;. Keys et al 1999;. Weatherbee et al 1999).. O protocolo atual foi adaptado de um protocolo detalhado disponíveis mediante solicitação por escrito do Laboratório Carroll para colorações asa larval. As mudanças que fizemos servem para acomodar as diferenças entre os tecidos asa de larva e pupa. Durante pupal dissecções asas posteriores, a membrana peripodial ...
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Agradecimentos
Agradecemos a Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadic, Bob Reed, Roche suporte técnico para ajudar na resolução deste protocolo. Agradecemos também a William Piel para aconselhamento sobre a edição do filme.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Tampão de Fixação | 4% Paraformaldeído em PBS | |||
| PBT | 0,1% Tween 20 em PBS | |||
| Solução de Proteinase K | 2,5mg/ml de Proteinase K em PBT | |||
| Tampão de Parada da Digestão | 2 mg/ml de glicina em PBT | |||
| Tampão de Pré-Hibridização | Para 50 ml de PHB: 12 ml de água tratada com DEPC + 25 ml de formamida + 12,5 ml de 20 x SSC + 50 µl de Tween 20 + 500 µl de esperma de salmão a 10 mg/ml (livre de RNase, desnaturado por calor antes da adição à solução). | |||
| Tampão de Hibridização | Adicionar glicogênio a 1 mg/ml ao tampão de pré-hibridização | |||
| Tampão de Bloqueio | 50 mM Tris pH 6,8, 150 mM NaCl, 0,5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml de BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | Conjugado com fosfatase alcalina |
| Conjunto de Tampões para Lavagem e Bloqueio com DIG | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount – Meio de Montagem Aquoso | Sigma-Aldrich | C0612 | Meio de Montagem |
Referências
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
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Reimpressões e permissões
