Imagem diferencial de estruturas biológicas com Duplamente-ressonante Scattering Anti-Stokes Raman coerente (CARS)

Resumo

A combinação de três único comprimento de onda curto lasers pulsados ​​é usado para gerar espalhamento anti-Stokes Raman coerente (CARS) e CARS duplamente ressonante (DR-CARS). A diferença entre estes sinais fornece maior sensibilidade para a outra forma difíceis de detectar sinais Raman coerente, permitindo que imagens de fraca dispersores Raman.

Resumo

Coerente técnicas de imagem Raman ter visto um dramático aumento na atividade na última década devido à sua promessa de permitir rótulo sem imagem óptica com alta especificidade molecular ^1. A sensibilidade destas técnicas, porém, é muitas ordens de grandeza mais fracas do que fluorescence, exigindo mili-molar ^1,2 concentrações molecular. Aqui, descrevemos uma técnica que pode permitir a detecção de concentrações fracas ou baixas de Raman ativos moléculas, amplificando seu sinal aos obtidos com os fortes ou abundante dispersores Raman. A interação de curto lasers pulsados ​​em uma amostra biológica gera uma variedade de sinais coerentes espalhamento Raman, cada um dos que carregam informações sobre a química única amostra. Normalmente, apenas um destes sinais, por exemplo, Coherent Anti-Stokes Raman (CARS), é usado para gerar uma imagem, enquanto os outros são descartados. No entanto, quando estes sinais, incluindo 3 cores CARS e quatro ondas de mistura (FWM), são coletados e comparados com o sinal de CARS, caso contrário, difícil de detectar informação pode ser extraída ^3. Por exemplo, carros duplamente ressonante (DR-CARS) é o resultado da interferência construtiva entre dois sinais de ressonância ^4. Demonstramos como ajuste dos três lasers necessários para produzir DR-CARS sinais para o 2845 centímetros vibração estiramento CH ^-1 em lipídios e os 2120 centímetros vibração CD ^-1 estiramento de uma molécula deuterada (por exemplo, açúcares deuterado, ácidos graxos, etc) pode ser utilizado para ambas as ressonâncias sonda Raman simultaneamente. Sob essas condições, além de CARS sinais de cada ressonância, um sinal DR-CARS combinado sondagem ambos também é gerado. Demonstramos como detectar a diferença entre o sinal DR-CARS e amplificando o sinal de vibração de uma molécula abundante pode ser utilizada para aumentar a sensibilidade para o sinal mais fraco. Nós ainda demonstrar que essa abordagem se estende até mesmo para aplicações onde ambos os sinais são gerados a partir de moléculas diferentes, de tal forma que por exemplo, usando o sinal forte Raman de um solvente pode melhorar o sinal fraco Raman de um soluto diluído.

Protocolo

1. Geração de carros e DR-CARS Sinais

A fim de gerar CARS e DR-CARS sinais simultaneamente, três sintonizável e sincronizadas curto fontes de laser pulsado são obrigatórios.

1. Para obter três pulsos sincronizados começamos com uma única de 10 W laser (PicoTrain, HighQ laser, Inc.). Este laser tem um comprimento de onda fixo de 1064 nm, um comprimento de pulso fixa de 7 ps, e taxa de repetição de 76 MHz fixos.
2. Usando uma série de meia onda placas e polarização divisor de feixe cubos o feixe é dividido em três partes. Uma placa de meia onda combinada com um cubo divisor de feixe de polarização que nos permite ajustar a quantidade de energia em cada componente do feixe sem alterar sua direção. Normalmente, os dois feixes são ajustados para ~ 4,5 W cada, eo feixe terceiro contém os restantes 1 W.
3. Os dois feixes de alta potência são, então, dirigido em dois osciladores paramétricos ópticos independentes (OPO, o Avante, APE GmbH, Berlin, Alemanha). Use OPO de geração de freqüência diferença para converter um fóton de maior energia em dois fótons de baixa energia com comprimentos de onda diferentes. Ao controlar a temperatura do cristal usado para conseguir esse efeito, os comprimentos de onda dos fótons resultantes podem ser controlados para dentro de 0,1 nm. Pela freqüência de duplicação estes sinais, um laser com um comprimento de onda fixo de 1064 nm pode agora ser transformada em um feixe de laser que pode ser sintonizado em qualquer lugar entre 780 nm até 910 nm. Bombeando dois separados OPO com a mesma fonte nm 1064, obtemos duas fontes de laser independentemente ajustáveis ​​que são automaticamente sincronizados com nosso laser bomba original.
4. O feixe (potência mais baixa), terceiro do laser da bomba 1064 nm é dirigido em torno da OPO é por uma combinação de espelhos dicróicos de modo que todas as três vigas (2 a partir do OPOS, 1 do laser da bomba) pode ser recombinados mais tarde. , A fim de produzir eficientemente coerente fótons do sinal Raman os pulsos recombinados devem ser sobrepostas tanto temporal e espacialmente. OPO porque contêm cavidades anel, permitindo que cada pulso de laser para passar os tempos de cristal múltiplas, as vigas enviados através de viagens a OPO é uma distância extra, resultando em um atraso considerável em relação ao feixe de bomba original. Esta distância deve ser compensado com o feixe de terceiro através da introdução de espelhos força extra que este feixe de viajar à mesma distância que os outros dois antes que eles são recombinados usando espelhos dicróicos.
5. A fim de proporcionar o ajuste fino do comprimento do caminho de cada raio viaja estágios atraso ajustável, utilizando retrorefletores prisma, são introduzidos em cada caminho do feixe.
6. Outro conjunto de meia onda placas e cubos de feixe polarizador divisor são adicionados a cada feixe para que possamos ajustar a potência de cada feixe de forma independente, sem afetar a entrada do da OPO.
7. Espelhos dicróicos são usados ​​para combinar o primeiro dos dois feixes de OPO e, em seguida, com o feixe de 1064 nm. Cuidados devem ser tomados para garantir que as vigas são precisamente sobrepostas (isto é, são colineares e têm divergência similar). Isto pode ser verificado através da comparação da sobreposição dos feixes de perto (dentro de alguns centímetros) e longe (~ 1 m) o espelho dicróico.
8. A vantagem de usar lasers pulsados ​​é que cada pulso pode ter um pico de energia de alta na amostra, permitindo a geração eficiente de sinais Raman coerente, mantendo uma intensidade média baixa. A intensidade média elevada pode danificar a amostra. Portanto, a fim de controlar ainda mais a intensidade média, sem sacrificar a energia de pico, os três feixes combinados são enviados através de um modulador eletro-óptico (célula Pockel, o ConOptics) funcionando como um selecionador de pulso, o que nos permite ajustar a taxa de repetição dos pulsos que chegar a nossa amostra e, portanto, a intensidade média.
9. Os feixes de laser são então combinados acoplada em um microscópio invertido com um objetivo NA alta. O objetivo é tipicamente uma lente objetiva 60 X de água com uma abertura numérica (NA) de 1,2, que foi corrigida para a aberração cromática em toda a gama de tunability do nosso OPO eo feixe de 1064 nm. O apertado foco gerado pela lente de alta objetivo NA permite a geração mais eficiente de sinais coerentes Raman na escala mícron.
10. Os feixes combinados são expandidos, a fim de sobrecarregue a volta da porta da objetiva do microscópio. Por overfilling parte de trás da objetiva do microscópio, podemos alcançar as melhores condições e, portanto, focando a melhor resolução espacial em nosso sistema de microscópio.
11. A lente objetiva em nosso microscópio é montada em um palco piezo XYZ que nos permite obter imagens de raster scanning as vigas em toda a amostra, similar ao comercial feixe de microscópios de varredura confocal.

2. O uso de três Curto Lasers Pulsada

O uso de três resultados a curto lasers pulsados ​​na produção de vários sinais CARS, a partir do c váriasombinations de dois lasers, bem como 3-Color CARS e DR-FWM sinais a partir da combinação de todos os três lasers.

1. Os comprimentos de onda dos sinais pode mentir espectralmente próximos uns dos outros. Quando os sinais estão juntos, pode ser difícil separá-las para análise, usando filtros de comprimento de onda fixo bandpass e espelhos dicróicos. Por esta razão, nossos sinais são transmitidos em um espectrômetro de imagem (2300i SpectraPro, Acton Research), que também serve como um monocromador eficiente para separar espacialmente sinais em diferentes comprimentos de onda.
2. Um espelho acionado eletronicamente virar dentro do espectrômetro na posição mais baixa envia o sinal para um retro-iluminado charge-coupled câmera do dispositivo esgotamento de profundidade (CCD), que fornece informações espectroscópicas em todo o alcance do sinal inteiro e permite-nos identificar e otimizar a coerente vários sinais Raman.
3. Para selecionar o sinal com o qual desejamos imagem que basta girar a grade dentro do espectrômetro, usando o fornecido pelo fornecedor de software de controle e aquisição de dados (WinSpec, Princeton Instruments), ao centro o pico de interesse na câmera CCD e altere a posição do espelho virar para redirecionar o sinal para uma porta de saída segundo a qual uma avalanche de contagem de fóton único foto-diodo (APD) foi anexado.
4. A lente objetiva é, então, raster-digitalizados e os sinais gravados na APD são usados ​​para gerar uma imagem, mostrando o fóton contam-rate para cada pixel através de dados de software de aquisição (SymPhoTime, Picoquant GmbH, Berlin, Alemanha).
5. Repetimos este procedimento para cada imagem desejada sinal coerente Raman, que nos permite comparar os sinais durante o pós-processamento.

3. Preparação da Amostra

A fim de obter imagens nítidas e reprodutíveis alguns cuidados devem ser tomados na preparação da amostra.

1. As amostras são geralmente preparadas em ~ 150 micron lamínulas de vidro de espessura. Estas lamelas são finos o suficiente para permitir imagens de alta resolução com o 1.2 Objectivos NA que são normalmente utilizados.
2. Captura óptica de objetos dielétrico pode ocorrer quando a luz do laser é difratado através de pequenos objetos transparentes. O uso de bem focada potência de pico, alto, curto feixes de laser pulsado pode então arrastar pequenas células ou bactérias junto, resultando em imagens borradas ou manchadas. , A fim de evitar isso, pode ser necessária para imobilizar a amostra na superfície da lamela de vidro pela primeira aplicação de uma fina camada de poli-L-lisina por revestimento rotacional.
3. Para células em cultura pratos de vidro de fundo a cultura pode ser utilizado para geração de imagens que permitem, sem a necessidade de separar as células do seu celular pratos de crescimento da cultura.
4. Para demonstração neste contribuição que primeiro depositar um C. formaldeído fixa elegans verme nematóide em uma lamínula de vidro.
5. Em seguida, adicione uma gota de 20 mL de solução de glicose 5 M deuterado para o worm. A solução de glicose deuterado oferece uma assinatura única de fundo e forte Raman.

4. Análise de amostra

Por forma a podermos aproveitar o efeito de aumento duplamente os espectros Raman ressonante de ambas as substâncias Raman ressonante deve ser conhecido.

1. Uma vez que a amostra é preparada na lamela é analisado usando um microscópio confocal Raman para a obtenção do espectro Raman espontâneo relevantes e identificar picos adequados.
2. Para executar DR-CARS que identificar os locais espectral do modo de estiramento CH, tipicamente associada com lipídios, eo modo de estiramento CD, associado com a glicose deuterado, a ser 2845 centímetros ^-1 e 2121 cm ^-1, respectivamente.
3. Espalhamento Raman coerente é alcançado quando a diferença de freqüência entre dois lasers coincide com a freqüência de uma vibração molecular. Pela OPO ajuste um a 817 nm que vai investigar a 2845 centímetros ^-1 modo de CH quando combinado com o feixe de laser 1064 nm e por meio do ajuste da OPO outros 868 nm vai investigar o pico de 2.121 centímetros ^-1 quando combinado com o feixe de 1064 nm .
4. Pela digitalização raster a amostra no microscópio CARS agora podemos observar três coerente sinais Raman de interesse. A CARS sinal de sondagem do CH alongamento vibração, um sinal de CARS sondando o modo de estiramento CD, e um sinal de DR-CARS sondagem ambos.
5. Nós selecionamos cada pico conforme descrito na Seção 2.3 e ter uma imagem como descrito acima.

5. Processamento de Imagem

Extração de informações adicionais com base nessas três imagens agora requer algum processamento de imagem bastante simples.

1. Primeiro as imagens devem ser normalizadas. Na normalização teoria pode ser alcançado pela contabilidade para a intensidade de cada laser envolvidos em cada processo de geração de sinal. Na prática, porém esta nem sempre funciona, principalmente devido à resposta espectral não uniformede espelhos dicróicos, detectores, e grades.
2. Um método prático para a normalização depende do fato de que em regiões onde lipídios pura dominam o sinal, a ressonância CD não deve contribuir para qualquer um dos sinais. Da mesma forma, em regiões de solução de glicose pura a ressonância CH não deve contribuir para qualquer um dos sinais. Com isto em mente, normalizar a imagem DR-CARS ea imagem CARS obtidos na ressonância CD da solução de glucose deuterado a uma região bem fora do C. elegans worm que deve apresentar nenhuma ressonância CH.
3. Então nós identificamos uma região dentro do worm na imagem CARS CH-ressonante que é rico em lipídios e normalizá-lo para a região correspondente na imagem DR-CARS normalizado. Para que esse método funcione corretamente, nós supor que no fundo esta região não deuterado glicose está presente. Esta é uma suposição segura desde que os lipídios são hidrofóbicos e não misturar com a solução.
4. Agora, subtraindo o normalizado CH-ressonante imagem CARS a partir da imagem DR-CARS normalizado ficamos com apenas o sinal amplificado CD-ressonante.
5. Da mesma forma, subtraindo o normalizado CD-ressonante imagem CARS a partir da imagem DR-FWM normalizado ficamos com apenas CH-ressonante do amplificado sinal.

6. Resultados representante

Figura 1: Diagrama de DR-CARS sistema de microscopia como descrito acima.

Figura 2: imagem de luz branca de um C. elegans verme em solução de glicose deuterado preparado em uma lamela de vidro e pronto para geração de imagens.

Figura 3:. Espectro Raman de ácido oléico modificados (um ácido graxo insaturado) que inclui uma modificação alcino (um carbono do grupo de carbono triple-bond) As ressonâncias CH forte em 2845 centímetros ^-1 ea ressonância alcino a 2100 cm ^-1 são ambos bem isolados da região de impressão digital (na região de picos densamente embalado), tornando-os marcadores ideal para imagens Raman coerente.

Figura 4:. Espectro típico de sinais coerentes Raman geradas quando três curtas-pulsado lasers são sobrepostas dentro da amostra As setas apontam para o processo (es) responsável por cada sinal representado por diagramas de energia. Nos diagramas mostrados aqui setas tracejadas indicam fótons do laser ea de OPO e setas sólidas indicam o sinal resultante. As linhas contínuas horizontais indicam a energia da vibração Raman e dar uma representação visual que, em DR-CARS, misturando os mesmos 3 fótons de entrada simultaneamente sondas dois diferentes vibrações Raman.

Figura 5: Os resultados típicos da imagem C. elegans worms usando DR-Carros e veículos. A linha superior usados ​​os três sinais indicados na Figura 4 para a imagem de um verme em uma solução de glicose deuterado. Na segunda linha as imagens foram devidamente normalizados e na terceira fila as imagens foram produzidas diferença, subtraindo cada uma das imagens CARS a partir da imagem DR-CARS.

Discussão

A espectroscopia Raman e Raman baseado em imagens são poderosas ferramentas emergentes nas ciências bio. Atualmente, isso é particularmente verdadeiro para o in vivo e in vitro do metabolismo celular e alterações metabólicas no processamento e armazenamento de lipídios. A maioria das bio-macromoléculas contêm um grande número de semelhantes, principalmente à base de carbono ligações moleculares, de modo que os espectros Raman obtidos a partir de células e organismos são tipicamente uma convolução de contribuições de lipídios, proteínas, ácidos nucléicos, açúcares, lipídios etc são relativamente fáceis para isolar a complexidade destes espectros, devido à sua tendência a formar gotas densas ou bicamadas e porque contêm longas cadeias com um grande número de ligações CH alifáticos. Nossa capacidade de isolar proteínas específicas, aminoácidos, RNA, DNA ou dentro do ambiente complexo celular é, no entanto, muito limitada. Isto é particularmente verdadeiro se estas moléculas de interesse só estão presentes em concentrações mM e abaixo. Aqui, a habilidade de sondar fraco ressonâncias Raman utilizando a nossa recém-introduzidas DR-CARS diferença técnica de imagem fornece uma abordagem potencialmente poderosas para o seu microanálise química e de imagem. É certo que a parte mais complicada deste protocolo é o alinhamento e sincronização do sistema de laser. Quando se inicia a partir do zero, a sincronização dos pulsos, ou seja, garantir que os pulsos são sobrepostos no tempo, apesar dos caminhos diferentes que toma pode ser facilitada pela utilização de um autocorrelador pulso. Sobreposição espacial e temporal, uma vez é atingido, CARS e DR-CARS sinais deve ser facilmente detectável. No entanto, o alinhamento do primeiro muitas vezes é bruto, resultando em sinais fracos. A melhor prática para alinhar este sistema também é inicialmente gerar sinais fracos e, em seguida, para melhorar a força do sinal suavemente ajustes dos espelhos ao longo de cada caminho e ajustar a sobreposição temporal utilizando as etapas atraso. Embora os atos espectrômetro / monocromador como um defletor muito eficiente para a luz ambiente o mais limpo resultados podem ser alcançados pela operação do sistema com as luzes da sala desligado e cortinas ou tubo de lente para minimizar fundo introduzidas pelas diversas outras fontes de luz (monitores de computador, por exemplo, luzes indicadoras, LEDs, etc.)

Nossa configuração particular utiliza a contagem de fóton único avalanche foto-diodo (APD) e detectores de tempo de contagem de fótons correlacionados único (TCSPC) para detecção de hardware ^5. Isso nos permite detectar sinais extremamente fracos com ruído relativamente baixo, mas muitos grupos têm encontrado foto multiplicador de tubos (PMT) com ganho variável vantajoso quando fazer medições semelhantes. A vantagem da PMT é que eles oferecem ganho variável e têm uma área de detecção muito maior que pode simplificar o alinhamento do detector. Além disso, a nossa configuração utiliza estágios piezo para traduzir o objetivo para alcançar Digitalização por feixe. A vantagem disso é que temos a capacidade de retornar para qualquer ponto dentro da imagem digitalizada anteriormente com um alto grau de precisão e tomar medidas adicionais, incluindo espectros Raman espontâneo. Outros grupos têm sido bem sucedidas montagens utilizando espelho de varredura, ou mesmo toda a unidades de varredura confocal, como o sistema FluoView Olympus, que oferece imagens muito mais rápido, mas é limitado em sua capacidade de retornar precisamente em locais arbitrários dentro de uma imagem.

Ajustando o lasers para coincidir com a ressonância Raman também é um passo crítico que pode exigir alguma otimização. Embora os picos Raman podem ser conhecidas a intensidade máxima de pico espectral obtidos a partir de DR-Carros e veículos não corresponde necessariamente ao máximo do pico Raman espontâneo. Isto é devido à interferência intrínseca de sinais gerados por quatro ondas de mistura levando a um sinal de fundo não-ressonante e CARS, o que distorce CARS espectros relativos aos espectros Raman espontâneo. A localização espectral do pico do sinal CARS pode ser calculado, mas uma abordagem mais prática é para sintonizar a OPOS em vários pequenos passos espectrais em todo o local esperado da ressonância Raman. Este processo deve render um máximo claro. De fato, para a maior sensibilidade da DR-FWM tanto ressonâncias deve ser ajustado para esse valor máximo.

Um último problema potencial da abordagem DR-CARS tem que ser discutido, ou seja, o sinal DR-CARS vai depender de uma distribuição homogênea da molécula Raman ativos ampliando. Para a maioria dos objetos biológicos, isso poderia muito bem ser a ressonância OH ampla da água, que é abundante e quase onipresente. A água é, no entanto, excluídos regiões hidrofóbicas com uma célula, como gotículas lipídicas, levando uma distorção dos sinais obtidos quando se utiliza a ressonância de água para amplificar os modos de lipídios. No nosso exemplo, usamos uma solução de glicose deuterado para gerar um sinal facilmente detectável e abundante para a nossa amostra biológica. Da mesma forma, deuterado água ou deuterado Buffe biológicars, tais como d-HEPES poderia ser usado. No nosso exemplo, o gotículas lipídicas dentro do C. elegans foram suficientemente pequeno para sempre contêm tanto, a solução de glicose e lipídios deuterado dentro do local de laser focalizado do nosso sistema. Isso, no entanto, geralmente não é verdade. Um exemplo particular seria adipócitos, que geram gotículas lipídicas dentro de seu bastante grande citoplasma. Isso significa que, qualquer experimento realizado com a técnica DR-CARS exige uma preparação cuidadosa e experimentos de controle para verificar os resultados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Objetiva de imersão em água 60X	Olympus Corporation	UPLSAPO 60XW
Microscópio invertido	Olympus Corporation	IX-71SIF-3
Célula de Pockels	ConOptics	350-160
Laser de bombeamento Picotrain	HighQ	IC-1064-10000
Oscilador paramétrico óptico	APE	Levante IR
Lâminas de vidro 1,5	Fisher Scientific	12-545-102 25cm-1
Placas de meia-onda	Thorlabs Inc.	AHWP05M-980
Cubos divisores de feixe polarizantes	Thorlabs Inc.	PBS052 ou PBS053
Espetroscópio/Monocromador	Princeton Instruments/Acton	Spectra Pro 2300i
Câmera CCD	Princeton Instruments/Acton	PIXIS: 100B
Fotodiodo de avalanche	PerkinElmer, Inc.	SPCM-AGR-14-12691
Estágio piezo XYZ	Physik Instruments	P 733-2CL P 721.CDQ	Esta é uma combinação de um estágio XY e um suporte Z para objetiva
Espelhos dicróicos	Semrock	Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25	Esses espelhos dicróicos específicos não são essenciais; qualquer conjunto com características apropriadas de transmissão/reflexão será suficiente.
Espelho dicróico	Chroma Technology Corp.	Z830rdc	Para combinar os diferentes feixes a laser no infravermelho próximo
Placa TCSPC	PicoQuant	Timeharp 200
Software de imagemamento Symphotime	PicoQuant
Matlab	Mathworks