Estudando os efeitos da rigidez Matrix em função celular usando acrilamida baseado Hidrogéis

Summary

O efeito da rigidez substratos em função celular podem ser modelados In vitro Usando hidrogéis de poliacrilamida de diferentes conformidades.

Abstract

Rigidez do tecido é um determinante importante da função celular, e mudanças na rigidez do tecido são comumente associados com câncer, fibrose e doenças cardiovasculares ^1-11. Abordagens tradicionais de células biológicas para estudar a função celular envolvem a cultura de células em um substrato rígido (pratos de plástico ou de lamínulas de vidro) que não pode explicar o efeito de um ECM elástica ou as variações de ECM rigidez entre os tecidos. O modelo em condições de tecido vivo cumprimento in vitro, nós e os outros usam ECM-revestido hidrogéis. Em nosso laboratório, os hidrogéis são baseados em poliacrilamida, que podem imitar a faixa de tecido conformidades visto biologicamente ^12. "Reativa" lamínulas são gerados por incubação com NaOH seguidos pela adição de 3-APTMS. Glutaraldeído é usado para cross-link 3-APTMS eo gel de poliacrilamida. A solução de acrilamida (AC), bis-acrilamida (Bis-AC) e persulfato de amônio é utilizado para a polimerização do hidrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) é incorporado a solução CA para crosslink proteína ECM para o hidrogel. Após a polimerização do hidrogel, a superfície do gel é revestido com uma proteína de ECM de escolha, tais como a fibronectina, vitronectina colágeno, etc

A rigidez de um hidrogel pode ser determinada por reologia ou microscopia de força atômica (AFM) e ajustado pela variação do percentual de AC e / ou bis-AC na solução ^12. Desta forma, a rigidez substrato pode ser combinada com a rigidez dos tecidos biológicos que também pode ser quantificada através de reologia ou AFM. As células podem ser semeados nesses hidrogéis e cultivadas com base nas condições experimentais necessárias. Imagem das células e sua recuperação para a análise molecular é simples. Para este artigo, definimos substratos moles como aqueles que têm módulos elásticos (E) <3000 Pascal e substratos rígidos / tecidos como aqueles com E> 20000 Pascal.

Protocol

Preparação

• Lamínulas devem ser autoclavados.
• Água destilada ou deionizada estéril deve ser utilizada para preparar soluções e lamínulas para lavar roupa.
• AC (40% w / v) e bis-AC (1% w / v) soluções são esterilizados por filtração 0,2 mM. Prepare persulfato de amônio 10% (APS; água 100μg/ml), pouco antes de usar e filtro estéril. Substituir a solução APS mensal.
• Reagentes químicos, tais como 3-APTMS, clorofórmio, glutaradehyde, NHS, e SurfaSil que não podem ser autoclavados são mantidos em uma garrafa atribuído utilizados exclusivamente para a preparação de hidrogéis.
• Para melhores resultados, hidrogéis deve ser utili....

Discussion

Um elemento crucial do processo de polimerização hidrogel é evitar a formação de bolhas de ar que vai permitir que as células se ligam à lamela de vidro, em vez de o hidrogel ECM revestido em si. Isto pode ser evitado com cuidado pipetagem a solução de polimerização após vórtex e visualmente para que não se têm bolhas de ar ficam presas no gel. Recomendamos sempre a preparar adicionais "reativa" lamínulas e hidrogéis para garantir ter o suficiente para a experimentação.

Atenção esp.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glutaraldeído, 70%	Sigma-Aldrich	G7776	Loja em -20° C
3-APTMS (3-Aminopropiltrimetossilano 97%)	Sigma-Aldrich	281778	Armazenar em temperatura ambiente
SurfaSil Siliconizing Fluid	Thermo Fisher Scientific, Inc.	42800	Armazene em temperatura ambiente
NHS (Éster N-hidroxisucinimida)	Sigma-Aldrich	A-8060	Armazene em 4° C Substitua mensalmente
a albumina, soro bovino, essencialmente livre de ácidos graxos	Sigma-Aldrich	A6003-100G	Loja na 4° C
Lamínulas (25mm)	Fisher Scientific	12-545-86 25 Cir 1D
Lamínulas (18mm)	Fisher Scientific	12-545-84 18 Cir 1D