Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Resumo

Aqui nós descrevemos um procedimento para a geração de adaptação ao escuro fatias da retina do rato para gravações eletrofisiológicas.

Resumo

Nossa experiência visual é iniciada quando o pigmento visual em nossa fotorreceptores da retina absorve fótons de energia luminosa e inicia uma cascata de eventos intracelulares que levam ao encerramento do cíclica de nucleotídeo-gated canais na membrana da célula. A mudança resultante no potencial da membrana leva, por sua vez a redução na quantidade de liberação de neurotransmissores dos dois rod e terminais de cone sináptica. Para medir o quanto a mudança de luz evocada em fotorreceptoras potencial de membrana leva a atividade a jusante na retina, os cientistas fizeram gravações eletrofisiológicas das preparações fatia da retina para ^1,2 décadas. No passado, essas fatias foram cortadas manualmente com uma lâmina de barbear no tecido da retina que é anexado ao papel de filtro; nos últimos anos um outro método de corte tem sido desenvolvida através do qual o tecido da retina é incorporado em agar baixa temperatura de gelificação e cortados em solução legal com um vibrando micrótomo ^3,4. Esta preparação produz fatias da retina com menos danos superficiais e muito robusto respostas luz evocado. Aqui nós documento como esse procedimento pode ser feito sob a luz infravermelha para evitar a descoloração do pigmento visual.

Protocolo

1. Eletrodos preparar

1. Preparar os eletrodos de registro e referência por imersão-los tanto em NaCl 1M e dirigir 15V entre eles usando uma onda senoidal 1 Hz ~ 20 para s.
2. Fazer a gravação usando eletrodos de um puxador de micropipeta (Sutter Instruments P-97). Para patch-pipetas usar um vidro de borosilicato com um diâmetro exterior de 1,2 mm e um diâmetro interno de 0,69 mm (Sutter Instruments, Cat # B120-69-10). Medir a resistência em série com a ponta do eletrodo. Com base no tamanho das células-alvo escolher uma ponteira de diâmetro, por corpos celulares ~ 20 mM em uso diâmetro ~ 5 mohms de corpos celulares ~ 5 mm de diâmetro em uso ~ 12 mohms....

Discussão

Gravação fatia de retinas vertebrados têm sido feitas há décadas ^1,2, e têm sido bastante bem sucedidos em fornecer uma compreensão mais profunda de como o circuito da retina codifica luz incidente. As vantagens do corte em micrótomo vibrando em vez de diretamente com uma lâmina de barbear é que as fatias da retina incorrer menos danos na superfície. Com uma pipeta de sucção é fácil de remover esse dano e células-alvo saudável logo abaixo da superfície que possuem conectividade no circuito da retina, onde a m.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Puxador de micropipetas	Sutter Instrument Co.	P-97
Vidro borossilicato	Sutter Instrument Co.	B120-69-10
Tubo de polietileno	Intramedic	PE205
Ágar	Sigma-Aldrich	A7002
Agarose com baixa temperatura de gelificação	Sigma-Aldrich	A0701
Meio de Ames’	Sigma-Aldrich	A1420
Penicilina-Estreptomicina	Sigma-Aldrich	P0781