Estudo Influência Heterogeneidade células gliais no crescimento Axon Usando um método de co-cultura New

Resumo

Neste protocolo, descrevemos um novo método para estudar a influência da heterogeneidade das células gliais no crescimento do axônio com uma In vitro Sistema de co-cultura. Rat cortical células gliais foram cultivadas a confluência e cocultured altamente purificado com ratos neurônios do gânglio dorsal da raiz. Influência das células gliais em diferentes neurônios adesão e crescimento do axônio foi comparado diretamente na mesma cultura. Este método oferece uma nova forma de estudar diretamente a influência heterogeneidade glial células em neurônios de adesão e crescimento do axônio.

Resumo

No sistema nervoso central de todos os mamíferos, os axônios cortados após a lesão não são capazes de regenerar as suas metas originais e recuperação funcional é muito pobre ^1. O fracasso do axônio regeneração é um resultado combinado de vários fatores, incluindo o ambiente hostil de células gliais, as moléculas inibidoras de mielina relacionadas e diminuição da capacidade de regeneração intrínseca neurônio ^2. Astrócitos são o tipo de célula glial predominante no sistema nervoso central e desempenham papel importante nas funções do axônio em fisiologia e patologia condições ^3. Contraste com os oligodendrócitos homólogos, os astrócitos são uma população heterogênea de células compostas por diferentes subpopulações de astrócitos com morfologias diferentes e expressão do gene ^4. O significado funcional dessa heterogeneidade, tais como suas influências sobre o crescimento do axônio, é largamente desconhecida.

Para o estudo da célula glial, especialmente a função da heterogeneidade de astrócitos no comportamento dos neurônios, foi estabelecido um novo método de co-cultura purificada de alta neurônios gânglios da raiz dorsal com células gliais obtidos a partir do córtex de ratos. Por esta técnica, nós fomos capazes de comparar diretamente adesão neurônio e crescimento do axônio em diferentes subpopulações astrócitos sob a mesma condição.

Neste relatório, nós damos o protocolo detalhada deste método para astrócitos isolamento e cultura, gânglios da raiz dorsal de isolamento e purificação neurônios, e os co-cultura de neurônios DRG com astrócitos. Este método também pode ser estendido para outras regiões do cérebro para estudar celular ou regionais específicos de interacção entre os neurônios e células gliais.

Protocolo

1. Cultura de Células da glia

Células gliais podem ser cultivadas em diferentes regiões do sistema nervoso central. Todo o processo é mostrado na figura processo.

Dia 1 placa de cultura de revestimento e lamínulas

1. Rodada microscópio seco esterilizado de vidro lamínulas em autoclave.
2. Placa as lamelas esterilizados em placa de cultura esterilizado de 24 poços.
3. Brasão as lamelas com poli-lisina e incubar por 2 horas sob temperatura de raiz.
4. Revestir as placas de 6 bem a cultura da mesma maneira como no passo 3.
5. Lavar as lamelas e 6 bem-placa de cultura duas vezes com água destilada e ar seco no capô cultura.
6. Adicionar 200 mL meio DMEM (com FBS 10%) em cada poço em 24 poços da placa e 2 mL em cada poço em 6 bem-prato e colocá-los em incubadoras com menos de 37 graus com 5% de CO ₂

Córtex dia 2 de isolamento e cultura de células gliais

1. Esterilizar o capô dissecção positiva de fluxo.
2. Ligue a luz UV por 20 min.
3. Spray de todas as superfícies com álcool 70% e esperar 15 min antes do uso.
4. mudança tensa: filhotes de ratos Anesthetize (P2-P6) por hipotermia, e decapitar na base do magnum framen usando uma tesoura operacional.
5. Abrir o crânio ao longo da sutura sagital utilizando uma tesoura de íris e descolar do crânio.
6. Remover o cérebro anterior e colocá-los em meio L15 refrigerados, sob estereomicroscópio, limpar cuidadosamente a membrana dura-máter e pia com os vasos sanguíneos, isolar o córtex e lave várias vezes com L15 médio.
7. Corte o córtex em pedaços pequenos com tesoura de microcirurgia.
8. Adicionar 0,125% de tripsina-EDTA preparado com L15 médio em pedaços córtex e incubar em 37 graus por 15 min.
9. Transferência de blocos de tecido em meio DMEM 20mL com FBS 20% em 50 mL do tubo, adicione DNase solução estoque para 10ug/mL concentração final, aspire a solução tecido cima e para baixo por 20 vezes com fogo de vidro polido Pasteure pipeta, recolher a suspensão de células individuais.
10. Lavar a suspensão de células com um tempo médio DMEM, re-suspender as células em DMEM com 10% de FBS, a contagem de células ao microscópio com um hemocitômetro células, semente de 5000-10000/cm ^2. Manter as células em uma incubadora de 37 graus de 5%, mudança de metade do meio 2 vezes por semana.

2. Dorsal Root Gânglios Neurônios Isolamento, Cultura e Purificação

Dia 1 Prepare Cultura Material

1. Revestimento do lamínulas esterilizadas com poli-lisina lamínulas, lave duas vezes com destilar a água eo ar seco, colocá-los em placas de 24 poços.
2. Adicionar médio Neurobasal 100μL com 2% B27 e NGF 2.5s (50 ng / mL), colocar placa em 37 graus 5% CO _2.

Dia 2 Isolate DRGs a partir de embriões

1. Esterilizados a capela de fluxo do mesmo modo como a cultura de células gliais.
2. Euthanize um rato grávidas (E15) por overdose com CO _2, abdômen esterilizados por etanol 70%, os embriões foram isolados do útero e colocado em meio L15 refrigerados.
3. Isolar cabos Espinhal com gânglios da raiz dorsal conectada sob estereomicroscópio e transferência para pratos de 35mm com média L15 refrigerados.
4. Coletar suspensão única célula e lave uma vez com NBF médio (médio Neurobasal contendo 2% B27 e 2.5s NGF (50 ng / mL)).

Dia 3 Purify neurônios DRG

1. 18h-24h após a semeadura neurônio, adicionar uma solução de 1 mM de ações concentradas FUDR à cultura neurônio para uma concentração final de 20 mM e um volume final de 200 mL.
2. 72h depois, substituir a metade da média com o meio Neurobasal contendo 2% B27 e 2.5s NGF (50ng/mL) sem FUDR. Depois disso, mude o meio de todos os outros dias.

3. Co-cultura de neurônios DRG com células gliais

1. Quando a cultura de células gliais chegou confluência (cerca de 20 dias após a semeadura), eles estavam prontos para co-cultura com os neurônios.
2. 24 horas antes de adicionar os neurônios purificada, médio células gliais foram alteradas para médio Neurobasal contendo 2% B27 e 2.5s NGF (50 ng / mL).
3. Neurônios purificada foram coletados de poços cultura, a suspensão de células individuais foram obtidos pela passagem mecânica através do fogo pipeta Pasteure polido.
4. Após contagem do número, os neurônios foram semeadas em 500/cm ² em células gliais confluentes em meio contendo 2% Neurobasal B27 e 2.5s NGF (50ng/mL).
5. Neurônios de adesão e crescimento neuritos em células gliais poderiam ser registrados e analisados ​​em momentos diferentes por um software de análise de imagem e imunocitoquímica utilizando anticorpos tipo específico de célula.

4. Resultados representante

1. Cultura de células gliais: Após a semeadura, as células gliais se tornará confluentes em torno de 20 dias. Microsc sob contraste de faseope, foi facilmente identificado que as diferentes subpopulações de células gliais morfológica formada subestruturas padrão diferente de crescimento e os astrócitos GFAP positivos representaram mais de 90% como mostrado pela técnica immuocytochemisty (Figura 1, Figura 2).
2. DRG cultura neurônios: Em nosso método, após 72 horas de tratamento FUDR, a pureza de neurônios DRG vai chegar tão alto quanto 99% dentro de seis dias, os neurônios DRG mostraram a sua morfologia única e com um crescimento de alta densidade neurite (Figura 3, Figura 4).
3. Co-cultura de células gliais e neurônios: os neurônios DRG adesão e crescimento de neuritos ocorreu prontamente em células da glia dentro de 4 horas após a semeadura, observações cuidadosas mostraram que a adesão neurônio e crescimento neurite foram influenciados por subpopulações de células da glia que formavam subestruturas padrão especial de crescimento, isso poderia ser facilmente identificados sob microscópio com contraste de fase e por imunocitoquímica (Figura 5, Figura 6).

Figura 1. Morfologia de células gliais confluentes. Cortical células gliais foram semeadas em lamínulas revestido polilisina e cultivadas por 20 dias, observe o padrão de crescimento diferentes de células gliais, as células do lado esquerdo e dispostos de forma radiada.

Figura 2. Confluentes células gliais rotulado por Glial ácidas anticorpo proteína fibrilar (GFAP). Note o arranjo radiado de GFAP (vermelho) células positivas no lado direito.

Figura 3. Neurônios dos gânglios da raiz dorsal cresceu in vitro sem tratamento FUDR. As células contaminantes formados DRG fundo neurônios.

Figura 4. Neurônios dos gânglios da raiz dorsal cresceu in vitro após tratamento FUDR. As células de fundo contaminação havia sido eliminada completamente.

Figura 5. Neurônios dos gânglios da raiz dorsal cultivadas em células gliais. Neurônios adesão e crescimento neurite foram inibidos nas células irradiadas organizado e limitado sobre as células gliais lado direito.

Figura 6. Neurônios dos gânglios da raiz dorsal que crescem em células gliais marcados por anticorpos neurofilamento. A neurite (verde) foram inibidos na irradiada dispostos células gliais lado esquerdo e limitado no lado direito, todas as células gliais foram marcados por GFAP anticorpo (vermelho).

Discussão

Este protocolo experimento foi projetado para atingir dois objetivos de estudar as células da glia, astrócitos influência heterogeneidade especialmente sobre neurônio adesão e crescimento neurite. O primeiro objetivo era manter a heterogeneidade astrócitos, tanto quanto possível, neste experimento, a célula glial confluentes astrócitos cultura enriquecida foi misturado cultura primária, sem qualquer tratamento químico e propagação de digestão, o que pode prejudicar ainda mais a célula e induzir a resposta a uma lesão de...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM (glicose alta)	Invitrogen	10313-039
Meio L15	Invitrogen	11415-114
SFB	Invitrogen	10437-077
Meio Neurobasal	Invitrogen	21103-049
poli-lisina	Sigma-Aldrich	P4832	grau para cultura
NGF (2,5S)	Invitrogen	13257-019
suplemento B27	Invitrogen	17504-044
tripsina-EDTA 0,25%	Invitrogen	25200-056
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503
anticorpo contra neurofilamento	Abcam	ab24575