Visualização de Larval Nervos segmentar em 3 Rd Instar Drosophila Preparações larval

Resumo

Drosophila melanogaster larvas fornecer um modelo de sistema ideal para investigar os mecanismos de transporte axonal dentro larval nervos segmentares. Usando este procedimento, ³ de larvas portadores de mutações diferentes podem ser comparadas às larvas do tipo selvagem.

Resumo

Drosophila melanogaster está emergindo como um sistema poderoso modelo para estudar o desenvolvimento e função do sistema nervoso, particularmente por causa de sua genética e conveniente genoma completamente seqüenciado. Além disso, o sistema nervoso das larvas é um sistema modelo ideal para estudar mecanismos de transporte axonal como os nervos larval segmentar contêm feixes de axônios com seus corpos celulares localizados dentro do cérebro e os seus terminais terminação nervosa ao longo do comprimento do corpo. Aqui nós descrevemos o procedimento para a visualização de proteínas dentro das vesículas sinápticas larval nervos segmentares. Se feito corretamente, todos os componentes do sistema nervoso, juntamente com tecidos associados, tais como músculos e NMJs, permanecem intactas, não danificadas, e pronto para ser visualizado. 3 ^º larvas carregando várias mutações são dissecados, fixo, incubado com anticorpos das vesículas sinápticas, visualizados e comparados com larvas do tipo selvagem. Este procedimento pode ser adaptado para vários diferentes anticorpos synaptic ou neuronal e as mudanças na distribuição de uma variedade de proteínas pode ser facilmente observado dentro larval nervos segmentares.

Protocolo

1. Preparação dos Reagentes

1. Prepare 1x tampão Dissecção com 128 mM NaCl, 4 mM CaCl _2, 4mm MgCl _{2, 2} mM KCl, HEPES 5mM e Sacarose 36mm. PH da solução a 7,2 e filtro de esterilizar.
2. Prepare o fixador utilizando 01:01 diluição de formaldeído 16% e solução tampão 1x Dissection.
3. Prepare 1x PBT usando 1x Tampão fosfato salino (PBS) em um PH de 7,2 e Triton X-100 em uma proporção de 1:100.
4. Prepare 5% albumina sérica bovina (BSA) com 0,01% Na Azida em 1x PBS.

2. Preparação para o Dissection

1. Sylgard pratos são usados ​​para dissecção. Prepare os pratos derramando Sylgard 184 base de elastômero de silicone de cura e agente de mistura em uma placa de Petri. Deixe a mistura solidificar completamente e seco antes de usar.
2. Antes da dissecação, reunir um par limpo de # 5 fórceps, um par de tesouras limpas lâmina reta Vannas, e pinos.

3. Dissecção de 3 larvas ^rd

1. Coletar vagando 3 ^ª larvas de um genótipo específico em uma placa de Petri.
2. Lavar as larvas em água deionizada para se livrar da comida.
3. Coloque uma larva no prato Sylgard, com o lado dorsal. Pin a larva em suas extremidades anterior e posterior.
4. Colocar uma gota de tampão Dissection 1x na larva fixado. Usando uma tesoura fina beliscar a larva na linha média dorsal, perto da extremidade posterior. Usando a tesoura, cortar a cutícula larval da extremidade posterior até o final anterior.
5. Colocar uma gota de tampão Dissection nova 1x para a larva dissecados. Com um pino, pegar uma borda lateral da cutícula perto do meio da larva alfinete e da cutícula. Usando outro pino, o pino da borda lateral do segundo cutícula, como mostrado no diagrama. Dois pinos são usados ​​em cada lado lateral. Veja o diagrama abaixo.
6. Remova cuidadosamente os intestinos, órgãos de gordura, e traqueia, deixando apenas o cérebro com os dois lobos ópticos e gânglios ventral com os nervos segmentares anexado. O restante do procedimento é feito no prato Sylgard.

4. Fixação da Larva Dissecada

1. Incubar a larva dissecada em correção para 30 minutos, substituindo a correção a cada 15 minutos.
2. Após a fixação, enxaguar a larva em 1x PBT por 30 minutos, substituindo o buffer a cada 10 minutos. É importante notar que a larva deve ser sempre em um buffer.

5. Coloração de anticorpos da Larva Dissecada

1. Prepare o anticorpo primário, diluindo-lo para a concentração adequada em BSA 5% com azida em 1x Na PBT. Concentrações ideais serão diferentes para diferentes anticorpos.
2. Substituir a última 1x PBT enxaguar com a solução de anticorpos preparados primária, e incubar em câmara úmida a 4 ° C durante a noite. A câmara úmida é construído por um prato de revestimento de plástico com kim-limpa embebido em água.
3. No dia seguinte, lave a larva dissecados em 1x PBT por 30 minutos, substituindo o buffer a cada 10 minutos.
4. Prepare o anticorpo secundário, diluindo-o para a concentração adequada em BSA 5% com azida em 1x Na PBT, e incubar a larva com a solução de anticorpo secundário a 25 ° C por uma hora. Enrole a câmara úmida em folha para evitar a luz, como anticorpos secundários são sensíveis à luz.
5. Após a incubação, lavar a larva em 1x PBT por 30 minutos, substituindo o buffer a cada 10 minutos.

6. Montagem e visualização da Larva Dissecada

1. Antes de montar a larva no slide, prepare o slide, espalhando duas linhas verticais de unha polonês no meio, com um espaço suficiente para uma cobertura de vidro para se sentar (ver diagrama). Deixe a unha polonês secar completamente.
2. Coloque uma gota de tampão de montagem no espaço entre as linhas verticais unha polonês no slide (ver diagrama). O slide está pronto para a montagem.
   
   
3. Após o último enxágüe 1x PBT, remova os pinos lateral. Tenha cuidado para não rasgar a cutícula.
4. Remova cuidadosamente os dois pinos restantes e pegue a larva com uma pinça e coloque a larva horizontalmente no slide preparado. Certifique-se que a larva não é capotou e é orientada lado ventral para cima.
5. Delicadamente, coloque uma lamínula em cima e feche as bordas com unha polonês (ver diagrama). A larva está agora pronto para visualização sob um microscópio fluorescente.
   

7. Resultados representante

Figura 1: A imagem representativa da larval nervos segmentar a partir de um tipo selvagem larvum usando anticorpos contra a vesícula sináptica protéicas cadeia cisteína (CSP, Zinsmaier et al. 1994). Note-se que os nervos segmentares são suavemente manchado. Bar = 20Hm

Figura 2: A imagem representativa da larval nervos segmentar a partir de uma larva mutante proteína motora utilizando anticorpos contra a proteína de vesícula sináptica proteína cadeia cisteína (CSP). Note-se que os nervos segmentares mostram acumulações maciças que mancha brilhante para CSP (setas).

Discussão

Os nervos Drosophila larval segmentares são um poderoso sistema para estudar mecanismos de transporte axonal. Se o 3 ^º instar larval dissecção é realizada corretamente, todos os componentes do SNC, SNP e tecidos associados, tais como os músculos e NMJs, pode ser examinado dentro de uma larva único. Nós adaptamos este protocolo a partir do que foi publicado por Hurd e Saxton (1996). Este protocolo também pode ser adaptado para testar outros anticorpos neuronal, mas a otimização de anticorpos deve ser ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pinça Dumont #5	Fine Science Tools	11252-20
Pinças Minutien, Aço Inoxidável	Fine Science Tools	26002-10
Tesoura Reta Mcpherson-Vannas, 8 cm	Fisher Scientific	50822236
Vectashield, Meio de Montagem	Vector Laboratories	H-1000
Elastômero de Silicone Sylgard 184	Dow Corning	4026148
formaldeído, 16%	Electron Microscopy Sciences	15710
dCSP3	Banco de Híbridos para Estudos do Desenvolvimento
Alexa Fluor 568 Anti-Murino IgG de Cabra	Invitrogen	A-11004