Expressão, solubilização, detergente e Purificação de um transportador de membrana, as proteínas MexB resistência a múltiplas drogas

Resumo

Neste protocolo que demonstram a expressão, solubilização e purificação de uma proteína de membrana recombinantemente expressas, MexB, como um complexo proteína solúvel detergente. MexB é um transportador de membrana multirresistência do oportunista Pseudomonas aeruginosa bacteriana patogênica.

Resumo

Multirresistência (MDR), a capacidade de uma célula cancerosa ou patógeno para ser resistente a uma ampla variedade de estrutural e funcionalmente não relacionados drogas anti-câncer ou antibióticos, é um problema atual graves na saúde pública. Esta resistência a múltiplas drogas é em grande parte devido à energia dependente de bombas de efluxo de drogas. As bombas de expulsar drogas anti-câncer ou antibióticos para o meio externo, reduzindo sua concentração intracelular abaixo de um limiar tóxico. Estamos estudando a resistência a múltiplas drogas em Pseudomonas aeruginosa, um patógeno oportunista que causa infecções bacterianas em pacientes com diversos tipos de lesões ou doença, por exemplo, queimaduras ou fibrose cística, e também em imuno-comprometidos diálise, câncer e pacientes transplantados. As bombas de efluxo MDR grandes em P. aeruginosa são complexos tripartite composta por uma membrana interna antiporter prótons drogas (RND), um canal de membrana externa (OMF), e uma proteína linker periplasmic (MFP) ^1-8. As proteínas RND e OMF são proteínas transmembrana. Proteínas transmembrana formam mais de 30% de todas as proteínas e são 65% dos alvos de drogas atual. Os domínios transmembrana hidrofóbica fazer as proteínas insolúveis em tampão aquoso. Antes de uma proteína transmembrana pode ser purificado, é necessário encontrar condições tampão contendo um detergente suave que permitem que a proteína seja solubilizada como um complexo de proteína de detergente (PDC) ^11/09. Neste exemplo, usamos uma proteína RND, o P. aeruginosa transportador transmembrana MexB, para demonstrar a forma de expressar uma forma recombinante da proteína transmembrana, solubilizar-lo usando os detergentes, em seguida, purificar o detergente complexos de proteína. Este método geral pode ser aplicado à expressão, purificação e solubilização de muitas outras proteínas da membrana recombinantemente expressas. Os complexos de proteína detergente pode ser usado posteriormente para a caracterização bioquímica ou biofísica, incluindo raios-X a determinação da estrutura de cristal ou estudos de reticulação.

Protocolo

1. Dia 1:

MexB de Pseudomonas aeruginosa é codificado por pFB101. O gene foi amplificado MexB de P. DNA genômico aeruginosa e inserida no NdeI e sítios de restrição XhoI do + pET30b vetor. A construção contém uma tag hexahistidine C-terminal.

1. O plasmídeo é usado para transformar E. coli cepa C43 (DE3) ^12, e os transformantes são semeadas em ágar LB contendo canamicina 30 ug / mL.

2. Dia 2: Culturas Pernoite:

2. À noite, 4 X 3 culturas LB contendo 30 mL de canamicina ug / mL são inoculados das colônias transformantes fresco. Alternativamente, as culturas podem ser inoculados a partir de uma perm congelados.
   Estas pequenas culturas são cultivadas em um rolo a 37 ° C durante a noite.

3. Dia 3: Growing 6 Culturas Liter:

3. Na parte da manhã, use as culturas durante a noite para inocular 150 mL contendo 30 LB canamicina ug / mL. Crescer a cultura a 37 ° C em um shaker.
4. Na parte da tarde, use a cultura pequeno para vacinar 6 x 1L 2XYT mídia contendo 30 ug / mL de canamicina em frascos Fernbach. (Use 25 ml por cultura para uma diluição de 1:40). Crescer as culturas a 37 ° C até atingirem uma DO ₆₀₀ de 0,4-0,6, cerca de 1,5 horas
5. Quando as culturas chegar a densidade adequada, induzir a expressão da proteína pela adição de 0,5 mL IPTG 1M. Coloque todos os frascos de volta no shaker e continuar a cultivá-las a 30 ° C durante a noite.

4. Dia 4: A colheita de células e purificação da proteína:

6. Adicionar inibidores da protease, DNAse, e lisozima às soluções de buffer da seguinte forma: a 50 mL de tampão de ressuspensão de células, adicionar 10 mg DNaseI (0,1 concentração mg / mL final), 1 Complete EDTA livre comprimido inibidor da protease, e uma pitada de lisozima . A 60 mL de tampão de ressuspensão de membrana, adicionar 1 comprimido inibidor da protease. Para outro de 50 mL de tampão de ressuspensão de membrana, adicionar 1 comprimido inibidor da protease. Manter todas as três soluções no gelo.
7. Centrifugar as culturas 30 min 5000 rpm em grande escala de centrífuga para a colheita das células.
8. Ressuspender as células em 100 mL de buffer ressuspensão de células (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl _2, 1 Complete EDTA livre comprimido inibidor da protease, 0,1 mg / mL DNAse I, pitada de lisozima)
9. Passe a solução da célula duas vezes através de uma célula de pressão francesa em 12.000 psi (762 pressão manométrica). Recolher o lisado celular em um frasco mantido frio no gelo.
10. Transferir o lisado celular para SS34 tubos de centrífuga e centrifugar para remover detritos celulares por 30 min a 10.000 rpm a 4 ° C em um rotor SS-34.
11. Remova cuidadosamente o sobrenadante para tubos de ultracentrífuga Ti647.5. Centrifugação de 50 min a 40.000 rpm a 4C. Desprezar o sobrenadante.
12. Ressuspender o sedimento, que contém as membranas celulares, em aprox. 25 mL de tampão de ressuspensão de membrana (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, glicerol 5%, 1 Complete EDTA livre comprimido inibidor da protease).
13. Transferir a suspensão de membrana para um tubo de centrífuga limpo e centrifugar a 40.000 rpm em um rotor Ti647.5 por 50 min a 4 ° C.
14. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o pellet lavado membrana em 25 mL tampão de ressuspensão de membrana (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, glicerol 5%, 1 Complete EDTA livre comprimido inibidor da protease).

5. TM Solublization Protein:

15. Para as membranas ressuspenso (cerca de 25 mL), adicionar 6 mL DDM 10% (concentração final = DDM detergente 2%) Rock a mistura a 4 ° C por 2 horas.
16. Centrifugar a mistura a 40.000 rpm por 40 min a 4 ° C no rotor Ti647.5 para separar os complexos detergente proteína solúvel das proteínas insolúveis. Salve o sobrenadante, que contém os complexos detergente MexB proteína.

6. IMAC:

17. Misture o sobrenadante obtido a partir da rotação de alta velocidade com os grânulos de metal talon afinidade equilibrada em tampão de ressuspensão. Incubar por 1 hora em um rolo a 4 ° C.
18. Despeje a pasta em um corpo de coluna de fluxo por gravidade e descartar a fluir.
19. Lavar a coluna com 20 mL (10 volumes de coluna) de tampão de Encadernação e Wash IMAC (50 Nap mM, pH 7, 300 mM NaCl, glicerol 5%, 0,2% DDM)
20. Eluir a proteína com tampão de eluição IMAC (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% de glicerol, 250 mM imidazol, 0,2% DDM).
21. Tome 15 amostras mL das frações de eluição, misture com 15 tampão de amostra 2X SDS mL para análise por eletroforese em gel de poliacrilamida. Spin-30seg em microcentrífuga. Analisar as amostras em um 10% de poliacrilamida SDS gel para estimar a quantidade e pureza de MexB em cada fração.
22. Piscina das frações contendo os complexos de proteína MexB detergente e concentrá-las em um concentrador de giro a 4 ° C. Tenha cuidado para que a proteína não precipitar nesta step.

7. Coluna de filtração em gel:

23. Pré-equilibrar um Superose 12 HL 30/10 coluna com 24 mL de tampão execução (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, glicerol 5%, 0,2% de beta-octylglucoside), e esperar por uma base plana.
24. Lavar a Akta circuito de carga do sistema com tampão de corrida.
25. Filtrar a solução de proteína usando um filtro de seringa antes de aplicá-la à coluna.
26. Carga de até 240 mL da solução de proteína para a coluna, com uma concentração de proteína de até 5 mg / mL.
27. Executar 1,5 volumes de coluna (36 mL) de tampão, coletar frações 0,25 mL. O detergente MexB complexos de proteína deve eluir como um pico em torno de 10-15 mL de volume de eluição.
28. Take 5 mL de amostras das frações de pico. Mix cada amostra 1:1 com tampão de amostra 2X SDS. Analisar as amostras em gel de poliacrilamida 10% para estimar a quantidade e pureza de MexB em cada fração
29. Piscina as frações contendo MexB puro.

8. Resultados representativos:

Figura 1 inclui um gel de poliacrilamida com frações obtidos a partir de coluna a coluna IMAC e frações individuais da coluna de filtração em gel. Depois que a coluna de filtração em gel a proteína aparece pura por Coomassie gel de poliacrilamida corado. Figura 2 inclui um rastreio a partir da coluna de filtração em gel mostrando o pico principal do complexo de proteínas detergente eluição da coluna. O rendimento médio de proteína MexB é de aproximadamente 2 mg por 6 litros de cultura 2XYT.

Figura 1. SDS-PAGE em gel de purificação dos PDCs MexB. Lane 1, marcadores de peso molecular. 2, Pooled frações IMAC. 07/03, coluna Gel frações de filtração.

Figura 2. Exemplo de Resultados Gel Filtração para complexos de proteína MexB detergente (PDC).

Discussão

Além de multirresistência, muitas atividades vitais celulares, incluindo ion transporte, comunicação célula-célula, transporte de vesículas, a manutenção da estrutura celular e Interações Hospedeiro-Patógeno, envolvem proteínas que são incorporados na membrana da célula. Proteínas transmembrana formam mais de 30% de proteínas conhecidas e são as metas para a maioria dos fármacos em uso hoje. O dobramento imprópria ou atividade das proteínas transmembrana levar a importantes doenças genéticas, incluindo a fibrose cística...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tampão amostral de SDS	Bio-Rad	161-0737
Estirpe de E. coli C43(DE3)	Lucigen	60345-1
sulfato de canamicina	Sigma-Aldrich	K4378
meio 2XYT	Fisher Scientific	BP2466-2
meio LB	Fisher Scientific	AC61189-5000
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758
DNaseI	Fisher Scientific	BP3226-1
lisozima	Sigma-Aldrich	L7651
comprimidos de inibidor de protease sem EDTA, Complete	Roche Group	11 873 580 001
NaP monobásico	Sigma-Aldrich	S6566
NaP dibásico	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
MgCl2	Sigma-Aldrich	M1028
Glicerol	Fisher Scientific	BP229-1
n-dodecil-β-D-maltopiranosídeo	Anatrace	D310
tubos de 15 ml	Corning	430052
Agitador oscilante (See-Saw Rocker)	Fisher Scientific	SSL 4
resina de afinidade metálica Talon	Clontech Laboratories	635503
imidazol	Sigma-Aldrich	I5513
géis de PAGE-SDS de poliacrilamida a 10%	Bio-Rad	161-1454
tampão de corrida Tris/glicina/SDS para PAGE	Bio-Rad	161-0732
marcadores de peso molecular pré-coloridos Kaleidascope	Bio-Rad	161-0324
coluna Superose 12 30/10	GE Healthcare	12 10/300 GL
concentrador centrífugo Amicon	EMD Millipore	UFC801024
filtro de seringa	Fisher Scientific	SLFG R04 NL
frascos Fernbach	Fisher Scientific	09-552-39
agitador para frascos Fernbach	Fisher Scientific
sistema Akta	GE Healthcare
centrífuga de grande escala J6 com rotor JLA-8.1000	Beckman Coulter Inc.
frascos de centrífuga de 1 l	Beckman Coulter Inc.	969329
centrífuga RC-5	Thermo Fisher Scientific, Inc.
rotor e tubos SS34 de ângulo fixo	Thermo Fisher Scientific, Inc.
ultracentrífuga de piso Sorvall	Thermo Fisher Scientific, Inc.
rotor T647.5 e tubos com tampas	Thermo Fisher Scientific, Inc.	08322
Célula de Pressão Francesa	Thermo Fisher Scientific, Inc.	FA-032