Expressão, solubilização, detergente e Purificação de um transportador de membrana, as proteínas MexB resistência a múltiplas drogas

Summary

Neste protocolo que demonstram a expressão, solubilização e purificação de uma proteína de membrana recombinantemente expressas, MexB, como um complexo proteína solúvel detergente. MexB é um transportador de membrana multirresistência do oportunista Pseudomonas aeruginosa bacteriana patogênica.

Abstract

Multirresistência (MDR), a capacidade de uma célula cancerosa ou patógeno para ser resistente a uma ampla variedade de estrutural e funcionalmente não relacionados drogas anti-câncer ou antibióticos, é um problema atual graves na saúde pública. Esta resistência a múltiplas drogas é em grande parte devido à energia dependente de bombas de efluxo de drogas. As bombas de expulsar drogas anti-câncer ou antibióticos para o meio externo, reduzindo sua concentração intracelular abaixo de um limiar tóxico. Estamos estudando a resistência a múltiplas drogas em Pseudomonas aeruginosa, um patógeno oportunista que causa infecções bacterianas em pacientes com diversos tipos de lesões ou doença, por exemplo, queimaduras ou fibrose cística, e também em imuno-comprometidos diálise, câncer e pacientes transplantados. As bombas de efluxo MDR grandes em P. aeruginosa são complexos tripartite composta por uma membrana interna antiporter prótons drogas (RND), um canal de membrana externa (OMF), e uma proteína linker periplasmic (MFP) ^1-8. As proteínas RND e OMF são proteínas transmembrana. Proteínas transmembrana formam mais de 30% de todas as proteínas e são 65% dos alvos de drogas atual. Os domínios transmembrana hidrofóbica fazer as proteínas insolúveis em tampão aquoso. Antes de uma proteína transmembrana pode ser purificado, é necessário encontrar condições tampão contendo um detergente suave que permitem que a proteína seja solubilizada como um complexo de proteína de detergente (PDC) ^11/09. Neste exemplo, usamos uma proteína RND, o P. aeruginosa transportador transmembrana MexB, para demonstrar a forma de expressar uma forma recombinante da proteína transmembrana, solubilizar-lo usando os detergentes, em seguida, purificar o detergente complexos de proteína. Este método geral pode ser aplicado à expressão, purificação e solubilização de muitas outras proteínas da membrana recombinantemente expressas. Os complexos de proteína detergente pode ser usado posteriormente para a caracterização bioquímica ou biofísica, incluindo raios-X a determinação da estrutura de cristal ou estudos de reticulação.

Protocol

1. Dia 1:

MexB de Pseudomonas aeruginosa é codificado por pFB101. O gene foi amplificado MexB de P. DNA genômico aeruginosa e inserida no NdeI e sítios de restrição XhoI do + pET30b vetor. A construção contém uma tag hexahistidine C-terminal.

1. O plasmídeo é usado para transformar E. coli cepa C43 (DE3) ^12, e os transformantes são semeadas em ágar LB contendo canamicina 30 ug / mL.

2. Dia 2: Culturas Pernoite:

2. À noite, 4 X 3 culturas LB contendo 30 mL de canamicina ug / mL são inoculados das colônias transformantes fresco. Alter....

Discussion

Além de multirresistência, muitas atividades vitais celulares, incluindo ion transporte, comunicação célula-célula, transporte de vesículas, a manutenção da estrutura celular e Interações Hospedeiro-Patógeno, envolvem proteínas que são incorporados na membrana da célula. Proteínas transmembrana formam mais de 30% de proteínas conhecidas e são as metas para a maioria dos fármacos em uso hoje. O dobramento imprópria ou atividade das proteínas transmembrana levar a importantes doenças genéticas, incluindo a fibrose cística.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tampão de amostra SDS	Bio-Rad	161-0737
C43 (DE3) E. coli cepa	Lucigen	60345-1
sulfato de canamicina	Sigma-Aldrich	K4378
2XYT mídia	Fisher Scientific	BP2466-2
LB mídia	Fisher Scientific	AC61189-5000
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758
DNaseI	Fisher Scientific	BP3226-1
Lisozima	Sigma-Aldrich	L7651
Comprimidos completos inibidores de protease sem EDTA	Grupo	Roche 11 873 580 001
NaP monobásico	Sigma-Aldrich	S6566
NaP dibásico	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
MgCl2	Sigma-Aldrich	M1028
Glicerol	Fisher Scientific	BP229-1
n-dodecil-β-D-maltopiranosídeo	Anatrace	D310
Tubos de 15ml	Corning	430052
Gangorra Rocker	Fisher Scientific	Resina de afinidade metálica SSL 4
Talon	Clontech Laboratories	635503
imidazol	Sigma-Aldrich	I5513
10% poliacrilamida SDS PAGE géis	Bio-Rad	161-1454
Tris / glicina / SDS PAGE buffer de corrida	Bio-Rad	161-0732
Marcadores de peso molecular pré-fabricados Kaleidascope	Bio-Rad	161-0324
Superose 12 30/10 coluna	GE Healthcare	12 10/300 GL
Concentrador centrífugo Amicon	EMD Millipore	UFC801024
Filtro de seringa	Fisher Scientific	SLFG R04 NL
Frascos Fernbach	Fisher Scientific	09-552-39
Agitador para segurar frascos Fernbach	Fisher Scientific
Sistema Akta	GE Healthcare
J6 Centrífuga de grande escala com rotor JLA-8.1000	Beckman Coulter Inc.
Frascos de centrífuga de 1 l	Beckman Coulter Inc.
centrífuga RC-5	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Rotor e tubos de ângulo fixo SS34	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Sorvall modelo de piso Ultracentrífuga	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Rotor T647.5 e tubos com tampas	Thermo Fisher Scientific, Inc.	08322
Célula de Pressão Francesa	Thermo Fisher Scientific, Inc.	FA-032