O método de cultura de embriões de roedores inteiro usando o Rotator do tipo Sistema de Cultura Garrafa

Resumo

Técnica de cultura todo embrião de rato permite-nos cultura e embriões de ratos Ex vivo Condição durante períodos limitados, correspondendo a fases midgestation. Neste protocolo de vídeo, demonstramos nossos procedimentos padrão de cultura de embriões de ratos após toda E12.5 usando o rotator-tipo de sistema de cultura de garrafa.

Resumo

Todo embrião cultura técnica (WEC) foi desenvolvido em 1950 pela Nova e seus colegas, e aplicadas em biologia do desenvolvimento ^1. Embora o desenvolvimento e crescimento de embriões de mamíferos dependem criticamente a função da placenta, WEC técnica nos permite rato cultura e embriões de ratos condição de ex vivo durante períodos limitados, correspondendo a fases midgestation durante o dia embrionário (E) 6,5 E12.5 na mouse ou E8.5-E14.5 no rato ^{2, 3, 4.} No WEC, nós podemos diretamente alvo desejado áreas de embriões utilizando capilares de vidro fina porque os embriões podem ser manipulados sob o microscópio. Portanto, WEC roedores é uma técnica muito útil quando queremos estudar processos dinâmicos de desenvolvimento de embriões de mamíferos postimplanted. Até à data, vários tipos de sistemas têm sido desenvolvidos WEC ^1. Entre estes, o rotator-tipo de sistema de cultura de garrafa é mais popular e adequada para longo prazo de cultura de embriões em midgestation, ou seja, após E9.5 e E11.5 em camundongos e ratos, respectivamente ^1. Neste protocolo de vídeo, demonstramos nossos procedimentos padrão de WEC ratos após E12.5 usando um modelo refinado do sistema original rotador, que foi desenhado por New Cockroft e ^{5, 6,} e introduzir várias aplicações da técnica do CME para estudos em desenvolvimento de mamíferos biologia.

Protocolo

1. Configurando o sistema WEC

1. Conjunta de uma membrana M 0,22 filtro para o tubo de silicone de entrada no sistema ^{um WEC).}
2. Abrir a válvula de um cilindro de gás contendo O ₂ (95%) e CO ₂ (5%). Fluxo da mistura de gases no cilindro através da garrafa borbulhando contendo água esterilizada.
3. Ajustar o volume do fluxo de mistura gasosa a 50 cc.
4. Insira o tubo de silicone para deixar em uma garrafa de água e verificar o fluxo de mistura gasosa.
5. Girar o tambor com a velocidade de 20 rpm / min.

2. Preparação de meio de cultura

1. Rat-degelo imediata....

Discussão

Existem dois passos críticos no WEC roedores para o sucesso. Primeiro, o procedimento de dissecção deve ser preciso para não danificar embriões, especialmente os vasos sanguíneos. Segundo, o procedimento deve ser o mais rápido possível, porque o oxigênio e nutrientes não são mais fornecidos através da placenta após o isolamento do útero. Isto é crítico para os embriões mais velhos. No caso do WEC de ratos após E12.5, devemos transferir embriões dissecado em garrafas de cultura em 30 minutos.

.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome	Tipo	Companhia	Número de catálogo	Comentário
Criação WEC
WEC sistema (10-0310)	Ferramenta	Ikemoto Rika	010-0310	Um outro modelo pequeno também está disponível.
Silicon plug sem um buraco	Ferramenta	Ikemoto Rika	010-032-08
Cilindro de mistura de gás	Ferramenta	Nikko Sanso	-	Contendo 95% de oxigênio e dióxido de carbono de 5%. Ordem feita sob encomenda.
Regulador de gás	Ferramenta	Ono Seisakusho	WR-11
0,22 mM filtro Millex GS	Ferramenta	Millipore	SLGS033SS
Anestesia e isolamento do útero
Tesouras grandes	Ferramenta	Napox	B-7H
Fórceps	Ferramenta	Napox	A-3-2
Prato disposição Petri (90 mm x 15 mm)	Ferramenta	Iwaki	SH90-15	Deep-tipo de prato é o melhor para dissecção.
Isoflurano	Reagente	Abbott	B506	Para anestesia
Pentobarbital sódico	Reagente	Schering-Plough Saúde Animal	-	Para anestesia
Tyrode de solução salina	Reagente	-	-	De acordo como o protocolo na Ref. 2. Salvar a 4 ° C.
Cronometrado grávidas de ratos Sprague-Dawley	Animal	Charles Rivers Laboratories Japão	-
Preparação de meio de cultura
Garrafa de vidro cultura	Ferramenta	Ikemoto Rika	010-032-05
Frasco de cultura disposição	Ferramenta	Ikemoto Rika	010-032-06
Silicon ficha com buraco	Ferramenta	Ikemoto Rika	010-032-07
Folha de alumínio	Ferramenta	Qualquer empresa	-
Saco de autoclave	Ferramenta	Hogy	HM-26	Para garrafas de cultura
Saco de autoclave	Ferramenta	Hogy	HM-14A	Para plugues de silicone
0,45 mM filtro Millex HA	Ferramenta	Millipore	SLHA033SS
50 tubo cônico ml	Ferramenta	Becton Dickinson	352070
100 ml copo	Ferramenta	Iwaki	TE-32
Rat IC soro	Reagente	Charles Rivers Laboratories Japão	-	Referem-se a: Sr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81- (0) 45-474-9336; FAX: +81- (0) 45-474-9340
D (+)-Glicose	Reagente	Wako	041-00595
Antibióticos antimyotic líquido	Reagente	Gibco	15240
Dissecação de embriões
Tesoura oftálmica reta	Ferramenta	Napox	MB50-7	Para o corte da parede uterina
Tesoura oftálmica curvas	Ferramenta	Napox	MB54-2	Para cortar o saco vitelino
Fórceps # 5	Ferramenta	Vigor	T6715
Fórceps # 5F	Ferramenta	Regine	T6819
Pipeta de vidro	Ferramenta	-	-	Feito à mão usando pipeta Pasteur.
Saco de autoclave	Ferramenta	Hogy	HM-4	Para pipetas de vidro
Microscópio binocular	Ferramenta	Leica	Mz7s
Luz	Ferramenta	Leica	CLS 150XD
Óleo de pedra	Ferramenta	Yoko Uchida	833-2000	Para afiar de fórceps
Óleo de máquina	Ferramenta	Yoko Uchida	835-0000	Para afiar de fórceps