$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Configurando o sistema WEC
- Conjunta de uma membrana M 0,22 filtro para o tubo de silicone de entrada no sistema um WEC).
- Abrir a válvula de um cilindro de gás contendo O 2 (95%) e CO 2 (5%). Fluxo da mistura de gases no cilindro através da garrafa borbulhando contendo água esterilizada.
- Ajustar o volume do fluxo de mistura gasosa a 50 cc.
- Insira o tubo de silicone para deixar em uma garrafa de água e verificar o fluxo de mistura gasosa.
- Girar o tambor com a velocidade de 20 rpm / min.
2. Preparação de meio de cultura
- Rat-degelo imediatamente centrifugado (IC) de soro em 37,0 ° C b). Adicionar D-glicose (2 mg / ml) em soro descongeladas em um copo ml autoclavado 100. Meio de cultura deve ser preparado no nível de cultura primária (por exemplo, usando um capuz).
- Adicionar antibióticos antimicótico líquido (100x) para o soro com 1: 400 de diluição.
- Vaporize isoflurano restantes (devido à anestesia de ratos durante a coleta de sangue) do soro por 20 minutos em temperatura ambiente (RT) c).
- Esterilizar o meio de cultura usando um filtro de membrana 0,45 mM.
- Despeje 3,0 ml do meio em cada frasco de cultura e selar a parte superior de cada frasco com uma ficha de silício, coberta com folha de alumínio (ver ref. 14) d).
- Prepare três ou quatro pratos disposição de Petri contendo solução salina e de Tyrode).
3. Anestesia do rato e do isolamento do útero
- Anestesiar um rato timed-grávidas profundamente com anestésicos inalatórios ou parenteral.
- Limpar a área abdominal do rato anestesiado grávida de etanol 70%.
- Pick up a pele com uma pinça e exteriorizar a parede abdominal, cortando a pele com uma tesoura grande f).
- Pick up da parede abdominal com um par de fórceps e fazer em forma de U grandes incisões longitudinal na parede abdominal com uma tesoura grande até o nível torácico g).
- Arribar do intestino para o lado esquerdo com um par de fórceps e expor uma extremidade do útero ligado ao ovário.
- Pegue o final do útero com uma pinça e corte a posição entre o útero e ovário com uma tesoura grande.
- Tirar o útero de ratos fêmeas grávidas, cortando a gordura ao redor do útero até a outra extremidade do útero.
- Transferência do útero para uma placa de Petri contendo solução salina de Tyrode.
- Euthanize o rato por excesso de administração de anestésicos ou deslocamento cervical após a remoção do útero.
4. Remoção dos embriões do útero
- Brevemente lavar o útero em solução salina Tyrode e transferi-lo para a segunda placa de Petri com um par de pinças finas h).
- Sob um microscópio binocular, pegar a parede uterina com um par de pinças finas e cortar a parede uterina no lado oposto ao mesométrio conectar-se com os vasos sanguíneos usando uma tesoura oftálmica em linha reta.
- Insira a ponta de uma tesoura oftálmica em linha reta no espaço entre a parede uterina e decídua. Cortar a parede uterina longitudinalmente ao longo do lado antimesometrial.
- Moita a decidua no lado mesometrial e conceptos separado do útero através de dois pares de pinças finas i).
- Transferência de conceptos à placa de Petri terceiro com uma pipeta de vidro esterilizados, com um diâmetro adequado.
5. Dissecação de embriões de ratos
- Inserir uma ponta do micropinças na decídua e fazer uma incisão transversal na decídua em torno do concepto com dois pares de fórceps.
- Inserir as pontas dos pinça na decídua no lado placentário e fazer duas incisões longitudinais na decídua até o topo.
- Remova a decídua no lado placentário rasgando que com dois pares de fórceps. Remover o decidua restantes com dois pares de fórceps.
- Pick up membrana de Reichert, faça uma incisão horizontal sobre o mesmo, e separar a membrana do concepto no lado anti-placentária.
- Faça um pequeno furo no saco vitelino perto da cabeça do embrião com os dois pares de fórceps, e cortar o saco vitelino com uma tesoura oftálmica curvas. É importante para não danificar os vasos sanguíneos.
- Pegue o âmnio no local em torno da cabeça do embrião com os dois pares de pinças finas, e retire com cuidado o embrião a partir do saco vitelino, rasgando o âmnio h). O corpo do embrião deve ser puxado para fora do saco vitelino para aumentar a oferta de oxigênio para o embrião no estágio midgestation.
6. Cultura de embriões todo
- Verificar danos na placenta, saco vitelino, e da condição do coração batendo e circulação sanguínea.
- Estar ciente de não esticar o cordão umbilical, a transferênciao embrião de um frasco de cultura com uma pipeta de vidro esterilizado. Reporte de solução salina Tyrode para garrafas de cultura deve ser o mínimo possível.
- Remover um plug de silicone não-buraco do tambor rotador. Conectar o frasco de cultura com uma ficha com um buraco no tambor rotator do sistema WEC perpendicularmente. Tenha cuidado para não colocar força no tambor em direções inadequadas desde o drum rotador é um equipamento muito bem. Os frascos contendo o embrião dissecados são transferidos para a cultura, um por um; abertura da porta da frente da incubadora devem ser minimizados para evitar que a temperatura da incubadora é diminuída j).
- Após 10 h de cultura, aumentar o volume de fluxo da mistura de gás de até 75 cc e até 100 cc após 24 h (Tabela 1).
- O meio de cultura deve ser mudado em torno de 24 horas através da transferência dos embriões cultivados em uma garrafa nova cultura com o meio recém preparado. Aumentar o volume de fluxo de até 125 cc, depois de 34 horas e até 150 cc após 48 h (Tabela 1)
- Ocasionalmente verificar a condição dos embriões cultivados contando taxa de batimentos cardíacos (ie, 120-150/min é ótima) e observando a circulação sanguínea. Se necessário contar o número de somitos para julgar o crescimento de embriões em solução salina de Tyrode. No desenvolvimento normal, um somito é adicionado em duas horas.
- WEC quando estiver terminada, pare de alimentação de mistura de gás e desconectar o tubo de entrada eo filtro de membrana para evitar o refluxo para dentro do tubo de entrada da garrafa borbulhando.
7. Notas
- A temperatura dentro do sistema WEC é constantemente mantido a 37,0-37,5 ° C.
- 100% rat IC soro é utilizado rotineiramente em nosso WEC de embriões de rato e do rato, e mantidos a -20 ° C antes do uso.
- Nós compramos rato IC soro, que é coletado de ratos que estão anestesiados com isoflurano.
- Garrafas descartáveis também estão disponíveis a partir de Ikemoto Rika. Garrafas e plugs de silicone devem ser autoclavados.
- Dissecação de embriões devem ser realizados à temperatura ambiente porque a manutenção de embriões em temperatura baixa ou alta durante a dissecção afetam o desenvolvimento posterior no WEC.
- Ferramentas para dissecção são esterilizados por calor seco.
- A pele e parede abdominal devem ser cortados separadamente para evitar a contaminação dos cabelos em um prato possível. Mudamos um par de tesouras e pinças grandes com um novo par deles quando cortamos a pele e isolar o útero, respectivamente.
- Utilizando uma pinça, cujas pontas são muito bem é muito importante para dissecar tecidos com certeza. Nós manualmente afiar as pontas de uma pinça com uma pedra e óleo de máquina.
- Usamos um lado da pinça como uma faca para evitar excesso de pressão de embriões.
- Quando a temperatura dentro do sistema WEC diminui, abrindo a porta repetidamente, continuamos a acender a luz para manter a temperatura dentro do sistema.
8. Resultados representativos
A Figura 1 mostra os procedimentos de dissecação do embrião de rato e embriões de ratos cultivadas.
Figura 1. Cultura de embriões Whole do embrião de rato E12.5. (A) A concepto dissecados do útero de ratos fêmeas grávidas. (B) Remoção da decídua no lado placenta. (C) remoção da membrana de Reichert. (D) Abertura do saco vitelino. (E) O cultivo de embriões de rato na garrafa durante 6 horas após o início do WEC. (F) O embrião de rato cultivadas por 42 hr. d, decidua; R; membrana de Reichert; p, placenta; ys, saco vitelino, e, embrião.
| 0 hr | 12 hr | 24 hr | 36 hr | 48 horas |
| E12.5 embrião de rato | 95% 50 cc | 95% 75 cc
(10 h) | 95% 100 cc | 95% 125 cc (34 hr) | 95% a 150 cc |
Tabela 1. Condições de oxigênio Optimal.