Artigo de método

Marcação específica de HIV-1 células positivas utilizando um Vector Rev-dependente Lentivirus Expressando a Proteína Verde Fluorescente

16.6K vistas

⸱

DOI:

10.3791/2198

⸱

23 de setembro de 2010

 ,  , 
1National Center for Biodefense and Infectious Diseases, Department of Molecular and Microbiology, George Mason University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Nós desenvolvemos um vetor lentiviral que possui, além da LTR Tat-responsivo, o elemento Rev-resposta (RRE), que pode regular a expressão do gene repórter de uma forma HIV-1 Tat e Rev-dependente. O vetor permite a detecção específica de HIV replicar em células vivas através da expressão da GFP.

Resumo

A maioria dos vetores de HIV-responsive expressão são baseados no promotor do HIV, a repetições terminais longas (LTR). Enquanto resposta a uma proteína HIV cedo, Tat, a LTR também é sensível aos estados de ativação celular e à atividade da cromatina locais onde a integração ocorreu. Isso pode resultar em atividade HIV-independentes de alto, e restringiu a utilidade do LTR baseado repórter às células marca HIV positivo 1,2,3. Aqui, construímos um vetor de expressão lentiviral que possui, além da LTR Tat-responsiva, inúmeras sequências de DNA do HIV que incluem o elemento Rev-resposta e os locais de emenda HIV 4,5,6. O vetor foi incorporado um vírus repórter lentiviral, permitindo a detecção altamente específico de HIV replicação em populações de células vivas. A atividade do vetor foi medida pela expressão da proteína fluorescente verde (GFP). A aplicação deste vector como o aqui relatado oferece uma abordagem nova alternativa aos métodos existentes, tais como PCR in situ ou a coloração do antígeno HIV, para identificar o HIV de células positivas. O vetor também pode expressar genes terapêuticos para a experimentação básica ou clínica para alvejar HIV-positivos células.

Protocolo

1. Transfecção de plasmídeos para Produção de Partículas do Rev-dependente Lentivirus

Set up: The Rev-dependente GFP vector lentiviral, PNL-GFP-RRE-SA, foi descrita anteriormente 4,5,6. Para montar em uma partícula viral, o plasmídeo foi contransfected em HEK293 células T com um HIV-1 construção de embalagens, pCMVΔ8.2 (gentilmente cedido pelo Dr. Dider Trono), e um plasmídeo carregando a glicoproteína VSV-G (pHCMV-G) . A transfecção foi realizada usando o método de fosfato de cálcio.

Preparação de tampões: 10 X HBS (Hepes Buffered Saline) foi preparada pela dissolução de 5 g de Hepes, 8 g de NaCl, 0,37 g de KCl, 1 g de Dextrose, 0,103 g de Na 2 HPO 4 (anidro) em 100 mL de H 2 O. Alíquota the10 X tampão HBS em 1 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C. No momento da transfecção, converter o 10 X 2 X HBS para HBS com H 2 O (1: 5 de diluição), e ajustar o pH entre 7,05-7,12. (Para 10 mL 2 X HBS, que normalmente necessita de aproximadamente 50 mL de NaOH 1M). Filtro de esterilizar o tampão HBS 2X passando por um filtro Millipore 0,22 mM. CaCl tampão 2 foi feita pela dissolução CaCl 2 em 10 mM Hepes a uma concentração de 2M final. Ajustar o pH para 5,8, filtro de esterilizar o buffer e armazenar a 4 ° C.

Procedimento:

  1. Um dia antes da transfecção, as sementes de 2 x 10 6 células HEK293T em um prato de Petri de 100 mm, e cultivar células durante a noite em 10 mL DMEM + 10% FBS a 37 ° C, 5% de CO 2.
  2. No dia seguinte, retire o sobrenadante das células e substituir com 5 mL fresco DMEM + 10% FBS, as células continuamente cultura por 4 horas.
  3. Em um tubo de poliestireno 5 mL, adicionar 480 mL 2X tampão HBS.
  4. Em um segundo tubo de poliestireno 5 mL, adicionar 60 mL 2M CaCl 2 buffer, o DNA do plasmídeo, e transfecção tampão TE (1 mM Tris, 25 mM EDTA, pH 8.0) para um volume total de 480 mL. Para cada placa de Petri, plasmídeos deve ser adicionado na proporção de 10 mg de PNL-GFP-RRE-SA, 7,5 mg de pCMVΔR8.3, e 2,5 mg de pHCMV-G.
  5. Adicione o plasmídeo DNA-CaCl 2 mistura gotas ao tubo de 2 HBS X, e incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. A multa será precipitar formulário.
  6. Adicione a 960 mL da mistura de gotas, com uma pipeta para as células. Incubar a 37 ° CO C, 5% 2 durante a noite.
  7. No dia seguinte, remover o sobrenadante e adicionar 10 mL fresco DMEM + 10% FBS, e continuamente incubar as células a 37 ° CO C, 5% 2 durante a noite.
  8. Menos 48 horas após a transfecção colheita, o vírus através da remoção do sobrenadante e transferindo-o para 50 mL tubos estéreis. Adicionar 10 mL fresco fresco FBS DMEM + 10% em cada Placa de Petri e continuar a cultura durante a noite. Armazenar o sobrenadante vírus a 4 ° C.
  9. Continuar a colheita em 72 horas após a transfecção, recolhendo o sobrenadante. Combine todos os sobrenadantes e centrifugar o sobrenadante a 500 xg por 15 minutos para pellet e remover restos celulares.
  10. O sobrenadante foram coletadas e filtradas por um filtro Millipore 0,22 mM. O vírus foi mais concentrado através de tamanho-exclusão colunas.

2. Concentre-se partículas virais e Determine título viral

  1. Partículas virais foram concentrados por uma coluna de tamanho-exclusão (100.000 MW cortado, Centricoin). Sobrenadante viral foi carregado na coluna e centrifugado a 6000 xg, a 4 ° C por 15 minutos.
  2. Sobrenadante viral concentrado foi coletadas, aliquotado e armazenado a -80 ° C.
  3. O título viral foi determinada por infecção de uma TNF-tratadas, HIV-1 linha celular positiva Jacket, J1.1 7. As células foram cultivadas em uma placa de 96 poços de 2,5 x 10 5 células por mL (100 mL de volume total), e infectados com 100 mL de serialmente diluída VNL-GFP-RRE-SA por uma semana. O título (TCID50) da partícula foi estimado pela contagem dos poços GFP positivas seguindo o método de Reed e Muench 8.

3. Marcação HIV-1 células positivas com o Particle Lentivirus, VNL-GFP-RRE-SA

Set up: um ser humano de células T CD4 linha, CEM-SS, foi o primeiro infectado com HIV-1. Menos 48 horas após a infecção, as células foram superinfected com as partículas lentiviral, VNL-GFP-RRE-SA. Seguintes superinfecção por mais dois dias, a GFP células positivas foram analisadas por citometria de fluxo. Como controle, não infectados pelo HIV-1 CEM-SS células foram infectadas com idêntica VNL-GFP-RRE-SA. Somente o HIV-1-infected CEM-SS células deram origem a células GFP positivas, mas não o HIV-1 não infectados CEM SS-células.

Procedimento:

  1. Duas horas antes da infecção, adicione polybrane para uma concentração final de 4 mg / mL. Contagem de células e tomar 2 x 10 5 células para cada infecção. Infectar as células com 200 ng (p24) do HIV-1 NL4-3 para 2 horas.
  2. Lavar as células por centrifugação a 300 xg por 10 minutos, ressuspendercélulas em 2 x 10 5 células / mL, e da cultura a 37 ° C por 48 horas.
  3. Contagem de células e tomar 2 x 10 5 células por infecção com VNL-GFP-RRE-SA. Adicione 100 ml de VNL-GFP-RRE-SA e incubar a 37 ° C durante a noite. Lavar e ressuspender as células em 2 x 10 5 células / mL.
  4. Realizar análises de citometria de fluxo em 48 horas após a superinfecção. Células infectadas foram peletizadas e ressuspenso em 500 mL paraformaldehede 1%, incubadas em temperatura ambiente por 20 minutos, e então analisados ​​em um analisador FACScan (Becton Dickinson).

4. Resultados representante

Se os experimentos são realizados com sucesso, uma população considerável GFP será detectada em HIV-1-infected CEM-SS células pelo citômetro de fluxo, enquanto que, no controle, as células GFP positivas não será detectada em HIV-1 não infectados CEM-SS células.

Se os experimentos são realizados com sucesso, o vetor Rev-dependente lentiviral, VNL-GFP-RRE-SA, irá permitir a detecção altamente específico de HIV replicação em que vivem populações de células, através da medição da fluorescência verde expressão da proteína (GFP). Neste exemplo, colhidas CEM-SS células foram marcadas com um anticorpo de rato PE-rotulados monoclonais contra CD24 do mouse, HSA, em seguida, analisados ​​em um citômetro de fluxo para ambos HSA e expressão GFP.

Figura 1
Figura 1. Como mostrado aqui, uma população considerável GFP foi detectado em HIV-1 as células infectadas com superinfected VNL-GFP-RRE-SA (Figura 1c). Em contraste, as células GFP positivas não foram detectados em ambos os HIV-1 não infectados CEM SS-células sem superinfecção lentiviral (Figura 1a) ou HIV-1 células não infectadas com superinfecção lentiviral (Figura 1b).

Discussão

Como com o anteriormente desenvolvidos vetores Tat-dependente expressão, o sistema Rev aqui descrito é uma exploração de um processo de HIV evoluiu. A inclusão de Rev-dependência torna o vetor de expressão LTR baseado altamente dependente da presença de HIV se reproduza. A aplicação deste vector como aqui relatado, um vírus HIV repórter-dependente, oferece uma nova abordagem nova para identificar o HIV de células positivas. O vetor permite o exame de células vivas, podem expressar todo o gene para a experimentação básica ou clínica, e como um lentivírus pseudo-digitado tem acesso a maioria dos tipos de células e tecidos.

Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

O trabalho foi suportado em parte pelo Serviço de Saúde Pública conceder 1R01AI081568 de NIAID para YW e pelas generosas doações dos doadores e os pilotos do 2009 do passeio organizado pela AIDS NYCDC M. Rosen e Inc. Day2

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cápsula de segurança biológica
Incubadora a 37°C e 5%CO2
Citômetro de fluxoFACSCalibur
CentrífugaBeckman Coulter Inc.Allega®6KR
Refrigerador a 4°C
Refrigerador a -20°C
Refrigerador a -80°C
Contador de célulasNexcelom BioscienceCellometer® AutoT4
Linhagem celular HEK293TInstitutos Nacionais de Saúde
Linhagem celular CEM-SSInstitutos Nacionais de Saúde
Linhagem celular Jurkat J1.1Institutos Nacionais de Saúde
DMEMInvitrogen11965-118
RPMI 1640Invitrogen21870
FBS HIInvitrogen10438-018
HIV-1NL4-3preparado por transfeção de células HeLa com DNA proviral clonado
pNL-GFP-RREdeleção completa de todos os ORFs do HIV em pNL4-3
pNL-GFP-RRE-SAInserir os segmentos A5 e D4 do HIV-1 em pNL-GFP-RRE
pCMVΔ8.2fornecido pelo Dr. Dider Trono
pHCMV-G
HBS 10x (solução salina tamponada com Hepes)Invitrogen11344-041
Tampão de CaCl2 2MInvitrogenS-013-154-10
Paraformaldeído 1%Sigma-Aldrich158127
Água sanitária
Tubos Falcon de 50 mlBD Biosciences358206
Tubos redondos de 5 mlBD Biosciences352063
Filtro Millipore de 0,45μMEMD MilliporeSLHA033SS
Filtro Millipore de 0,20μMEMD MilliporeSLFG85000
Placa de Petri de 100 mmSigma-AldrichCLS430588
Coluna de exclusão por tamanho (corte em 100.000 MW)Sartorius AGVS2041
Tubo congelador de 2 mlAxygen ScientificSCT-200
Placa de 96 poçosBD Biosciences353227
Tubo de microcentrífuga de 1,7 mLAxygen ScientificMCT- 175-C

Referências

  1. Garcia, J. A., Wu, F. K., Mitsuyasu, R., Gaynor, R. B. Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus. EMBO Journal. 6, 3761-3770 (1987).
  2. Merzouki, A. HIV-1 gp120/160 expressing cells upregulate HIV-1 LTR directed gene expression in a cell line transfected with HIV-1 LTR-reporter gene constructs. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand. 41, 445-452 (1995).
  3. Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects. AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).
  4. Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. Rev-dependent lentiviral expression vector. Retrovirology. 4, 12-12 (2007).
  5. Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. Rev-dependent indicator T cell line. Current HIV Research. 5, 395-403 (2007).
  6. Young, J., Tang, Z., Yu, Q., Yu, D., Wu, Y. Selective killing of HIV-1-positive macrophages and T Cells by the Rev-dependent lentivirus carrying anthrolysin O from Bacillus anthracis. Retrovirology. 5, 36-36 (2008).
  7. Perez, V. L. An HIV-1-infected T cell clone defective in IL-2 production and Ca2+ mobilization after CD3 stimulation. Journal of Immunology. 147, 3145-3148 (1991).
  8. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Detec o de Express o de GFPAn lise por Citometria de FluxoDetermina o do T tulo ViralTransfec o de HEK 293TConcentra o por Exclus o por TamanhoInfec o de C lulas T CD4Procedimento de Superinfec oEntrega de Gene Terap utico

Artigos relacionados