Isolamento de Células-Tronco da retina do olho do rato

Resumo

Neste vídeo, vamos demonstrar como isolar células-tronco na retina do epitélio ciliar do olho do rato e cultivá-las em cultura para dar forma clonal esferas da retina. As esferas que estão isolados possuem as propriedades cardeal de células-tronco: a auto-renovação e multipotencialidade.

Resumo

O adulto do rato com células-tronco da retina (RSC) é uma célula quiescente rara encontrada no epitélio ciliar (CE) do olho de mamífero ^1,2,3. A CE é composta por não-pigmentada interior e camadas de células pigmentadas exterior, e as colônias clonais RSC que surgem a partir de uma única célula pigmentada da CE são feitas de ambas as células pigmentadas e não pigmentadas que podem ser diferenciadas para formar todos os tipos de células da retina neural e RPE. Existe alguma controvérsia sobre se todas as células dentro das esferas contêm pelo menos cerca de ⁴ pigmento, porém as células ainda são capazes de formar os diferentes tipos de células encontradas na retina neural ^1-3. Em algumas espécies, como anfíbios e peixes, seus olhos são capazes de regeneração após a lesão ^5, no entanto, o olho dos mamíferos não mostra tais propriedades regenerativas. Procuramos identificar as células-tronco in vivo e para compreender os mecanismos que mantêm a retina de mamíferos as células-tronco quiescentes ^08/06, mesmo após a lesão, bem como usá-los como uma fonte potencial de células para ajudar a reparar os modelos físico ou genético de lesão ocular através do transplante ^9-12. Aqui nós descrevemos como isolar as células ciliares do epitélio do olho do rato e cultivá-las em cultura, a fim de formar a esferas clonal das células da retina-tronco. Como não existem marcadores conhecidos da célula-tronco in vivo, estas esferas são a única maneira conhecida para prospectivamente identificar a população de células-tronco dentro do epitélio ciliar do olho.

Protocolo

1. Preparar as soluções Dissecting e soluções enzimáticas

1. Faça o fluido cerebral Artificial Spinal (ACSF) eo soro de mídia livre antes do tempo e leve à geladeira.
2. Pesar o ácido cinurênico (0,2 mg / mL) e dissolver em 10 mL de hilo ACSF em um banho-maria 37 ° C antes do tempo, uma vez que não se dissolve prontamente.
3. Pesar a tripsina (1,33 mg / mL) e hialuronidase (0,67 mg / mL) e coloque em um tubo de 15 mL e mantê-lo a -20 ° C até ser necessário. Adicionar a solução de ácido cinurênico a este tubo e filtrar através de um filtro de seringa de 22 M apenas antes de usar.
4. Pesar inibidor de tripsina (Ovamucoid: 1 mg / mL) e dissolver em água morna soro livre de Mídia e filtro com filtro de seringa de 22μm.
5. Fazer a media chapeamento: Soro sem mídia contendo FGF2 (10 ng / mL) e heparina (2 mg / mL).

2. Isolar células estaminais da retina do olho do rato

1. Isolamento das células-tronco da retina é realizado em uma sala específica estéril dedicada a experimentos de cultura primária. Antes de iniciar este procedimento, configure o microscópio de dissecação e de luz fria de origem e, em seguida, estabelecer os instrumentos estéreis de dissecação. Cada capa tem um esterilizador quente talão para a esterilização dos instrumentos entre as etapas.
2. Vamos isolar células-tronco na retina dos olhos que foram colocados imediatamente em uma placa de Petri estéreis, contendo Fluid Cerebral Artificial Spinal (ACSF) após a sua retirada de camundongos sacrificados de acordo com a ética protocolos animais aprovados.
3. Sob o microscópio de dissecação, limpar o olho com uma pinça: livrar-se do cabelo e do tecido conjuntivo que é anexado à córnea / border escleral. Em seguida, transferir o olho a um novo prato com ACSF.
4. Enquanto delicadamente segurando o olho parado com uma pinça serrilhada, use ângulo micro-dissecando tesouras para remover os músculos oculares. Remover o nervo óptico, bem como se ele ainda está ligado ao olho. Tente não esmagar o olho durante este processo. Transferência de olhos para um novo prato com ACSF.
5. Use próxima curva micro-dissecando tesoura para cortar o olho ao meio: começar no nervo óptico e passou no meio da córnea, reunião de volta ao nervo óptico onde o corte foi iniciado. O ideal é que as duas partes do olho são aproximadamente equivalentes em tamanho, porque isso vai dar o próximo passo mais fácil.
6. Segurando as córneas utilizando duas pinças, descascar delicadamente o olho duas metades separadas. Remova e descarte a lente, vísceras, ea retina neural das conchas dos olhos. Transferir as cascas para um novo prato com ACSF.
7. Agora estamos prontos para isolar o epitélio ciliar. Para começar, orientar shell o olho para que a córnea está à sua direita eo epitélio pigmentado da retina (EPR) é à esquerda. Suavemente o pino shell olho para baixo com uma pinça reta do lado RPE.
8. Em seguida, use um bisturi para cortar a córnea ea íris longe do epitélio ciliar do olho empurrando levemente para baixo sobre o bisturi ao invés de usar movimentos de corte.
9. Depois disso, corte o epitélio ciliar longe do RPE. Uso não-serrilhada fórceps para transferir a faixa de epitélio ciliar de um prato de 35 mm contendo novas ACSF.
10. Da mesma forma, isolar o epitélio ciliar da shell outro olho.
11. Uma vez que ambas as tiras ciliar epiteliais foram recolhidos, transferir as tiras em um prato de 35 mm contendo 2 ml de Dispase. Coloque o prato com as tiras em uma incubadora de 37 ° C por 10 minutos.
12. Após 10 minutos, transferir as faixas a partir do Dispase em um prato contendo 2 ml de tripsina filtrado, hialuronidase e ácido cinurênico. Coloque o prato a 37 ° C por 10 minutos.
13. Agora retorne ao microscópio de dissecação. Enquanto mantém a esclera para baixo com uma pinça reta, use a parte inferior da curva não-serrilhada pinça para delicadamente raspar o epitélio ciliar longe da esclera.
14. Remova a esclera do prato. Tudo o que deve ser deixado no prato agora são as células de interesse e da solução enzimática.
15. Usando um fogo-polido algodão ligado de pipeta, transferir essa solução para um tubo de 14 ml. Triturar esta solução 30 vezes para quebrar as células epiteliais delicadamente forçando a solução dentro e fora da pipeta.
16. Centrifugar o tubo por 5 minutos a 1500 RPM. Quando a centrifugação estiver pronto, retire o tubo da centrífuga cuidadosamente vez que as células são propensas a saindo do fundo do tubo nesta fase.
17. Aspirar cuidadosamente a maioria do sobrenadante com uma pipeta-fogo polido, e em seguida, adicione 1 mL de inibidor de tripsina em soro livre de mídia para as células. Use um pequeno furo de algodão ligado de pipeta para triturar a amostra de cerca de 50 vezes até que é uma suspensão de uma única célula.
18. Centrifugar o tubo novamente por 5 minutos a 1500 RPM.
19. Remover o sobrenadante e substituí-la por 1 mL de seu meio de placas. Triturar delicadamente usando uma pipeta de vidro polido-fogo para ressuspender as células.
20. Depois que a contagemção das células da placa, eles na densidade desejada em uma placa de 24 cavidades. Nós placa geralmente 10 células / microlitro, preenchendo cada cavidade primeiro com o meio e depois da adição da suspensão celular para obter um volume final de 500 mL de mídia.
21. Coloque a placa em um 37 ° C incubadora de CO _2, onde não será movido até você contar as esferas que surgem após 7 dias.

3. Resultados de isolamento de células-tronco da retina

1. Quando este procedimento é realizado com sucesso, o dissecados ciliar células epiteliais deve ficar assim depois de ter sido dissociadas e banhado em baixa densidade (Figura 1).
2. Após 7 dias em cultura, as esferas de células-tronco da retina que surgem são contados. A esfera deve ser superior a 75 m de diâmetro e livre-flutuante para ser contada como uma célula-tronco derivadas esfera. (Figura 2). No entanto, algumas células terão esferóides limitada proliferação e de formulário que não atender critério de tamanho e não será contado como esferas de células-tronco derivadas; um exemplo de um esferóide como é mostrado aqui (Figura 2).

4. Resultados representante

Figura 1.

Figura 2.

Discussão

Este protocolo descreve como isolar células-tronco na retina do epitélio ciliar do mouse ocular ^1-3. A metodologia para isolar as tiras de epitélio ciliar pode variar, no entanto as enzimas e metodologia para alcançar uma suspensão de uma única célula foram otimizados neste protocolo. Também é importante que as tiras do epitélio ciliar que foram isolados não contêm grandes quantidades de RPE ou córnea uma vez que estes parecem ter um impacto negativo sobre o número total de esferas que podem ser isoladas de cada olho. Além disso, os meios de comunicação sem soro que fazemos que foi originalmente formulado para o cérebro neurospheres ^13, é ideal para o cultivo de células da retina esferas tronco. Deve-se também certificar-se que as células não sejam perturbados depois de terem sido banhado e colocado na incubadora para que as esferas de crescimento não se agregam em conjunto ^14.

Uma vez que as células-tronco da retina formaram esferas clonal, que pode ser contado para obter um número potencial de células-tronco por olho. As esferas, em seguida, pode ser dissociada em células individuais e várias passagens para verificar auto-renovação ou capacidades diferenciadas em diferentes tipos de células da retina neural e RPE usando diferentes combinações de fatores de crescimento e / ou proteínas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscópio Stemi 2000	Carl Zeiss, Inc.
Fonte de Luz Fria	Carl Zeiss, Inc.	KL1500	luz óptica com braço duplo
Tesoura Mini Vannas Curva	Fine Science Tools	15000-10
Tesoura Vannas Angular	Fine Science Tools	15005-08
Pinzas #7 Dumont	Fine Science Tools	11272-30	não serrilhadas
Pinzas #5 Dumont	Fine Science Tools	11251-10	retas
Pinzas Finas	Fine Science Tools	11051-10	curvas serrilhadas
Porta-lâmina #3	Almedic	2586-M36-10
Lâminas de bisturi #10	Almedic	2580-M90-10
Esterilizador por Contas Quentes	Fine Science Tools	18000-45
Dispase	VWR international	CACB354235
Tripsina	Sigma-Aldrich	T1005
Hialuronidase	Sigma-Aldrich	H6254
Ácido Cínurênico	Sigma-Aldrich	K3375	1000 UI
Inibidor de Tripsina	Roche Group	10109878001
Placas de 35 mm	VWR international	CA354235
Placa de 24 poços	VWR international	CA73521-004
Pipetas com algodão	VWR international	14672-400	polidas com chama
Tubos de 14 mL	Falcon BD	352057	Poliestireno
Meio sem Soro			Ref# 13 para formulação
FGF2	Sigma-Aldrich	F0291
Heparina	Sigma-Aldrich	H3149	100 UI