Protocolo para a Criação Mosquito (A. gambiae)

Resumo

Este vídeo ilustra as técnicas gerais usadas para a retaguarda Anopheles gambiae em laboratório. Os métodos para cuidar dos mosquitos laboratório são demonstrados por todos os estágios do ciclo de vida do organismo a partir de larvas de pupas a sangue-alimentação adultos.

Resumo

Este protocolo descreve a criação do mosquito no insetário. Os quartos são mantidos em insetário 28 ° C e ~ 80% humidade, com um hr 12. ciclo de dia / noite. Para este procedimento, você precisará de gaiolas mosquito, solução de sacarose 10% estéril, toalhas de papel, copo, papel de filtro Whatman, alimentadores de vidro, sangue humano e banho de água do soro, parafilme, água destilada, limpa bandejas de plástico, comida mosquito (descrita abaixo), mosquiteiro para cobrir as bandejas, a vácuo, e uma câmara de coleta para coletar adultos.

Protocolo

Alimento do mosquito:

1. Um alimento: comida de peixe aterrado (Aquaricare). Uma pitada pequena pode ser adicionada.
2. Alimentos B: aterrado alimentos CAT (Purina). Uma pitada pequena pode ser adicionada.
3. Alimentos C: cat alimentos (Purina). Dois comprimidos pode ser adicionada.

Sangue:

Sangue animal ou humano pode ser usado para mosquitos traseira. Sangue fresco é coletado com uma seringa e colocar em um tubo de 15 ml estéril Falcon contendo 1ml de CPD (anticoagulante) para cada 10 ml de sangue, então misturado delicadamente e centrifugado à temperatura ambiente a 2000 rpm por 5 min. O sobrenadante é descartado, tendo o cuidado de remover o revestimento buffy que compreende outras células sanguíneas (por exemplo WBC). O pellet RBC é então suspenso em um volume igual de meio RPMI por pipetagem, e novamente lavado nesse meio três vezes. Após a lavagem final, os eritrócitos são peletizadas ressuspenso em um volume igual de meio RPMI e armazenados a 4 ° C (pode ser mantida por 80-10 dias). Antes da alimentação, o RBC (em RPMI) é centrifugado (2000 rpm por 5 min) para pellet as células, ea RBC embalado é ressuspenso no soro (O + soro humano) para obter um hematócrito de 40%. O sangue deve ser mantida a 37 ° C sempre para a alimentação.

DIA 1:

1. O dia 05/03 mosquitos adultos do sexo feminino, são alimentados com sangue para botar ovos.
2. Para a alimentação de sangue, uma membrana artificial método de alimentação (parafilme) é usado como segue:
   
   
   1. Células vermelhas do sangue (ver acima para a preparação de sangue) são misturadas com soro inactivado pelo calor para obter um hematócrito ~ 40% (embalado RBC 40% e 60% de soro). Este é adicionado ao alimentador de vidro.
   2. O alimentador é ligado a uma jaqueta de água quente (37 ° C), e colocado na gaiola para permitir o acesso de mosquitos na superfície da membrana.
   3. Os mosquitos são permitidos aos alimentos para ~ 30 minutos.

DIA 3:

1. As fêmeas põem ovos dois dias depois que eles se alimentam de sangue. Um pequeno papel filtro envolto em um formato cônico é colocado em um pequeno copo contendo água destilada, tornando-se o papel filtro fica úmido. O copo é mantido dentro da gaiola durante a noite para os mosquitos botar ovos.

DIA 4:

1. O filtro de papel contendo os ovos do mosquito é colocado em uma bandeja de plástico com ~ 300 ml de água destilada. Uma pitada de alimento A é adicionado à bandeja e os ovos são autorizados a escotilha para larvas durante os próximos dias.

DIAS 5-8:

1. Larvas em crescimento são alimentados todos os dias com dois comprimidos de comida C, e monitorados para a densidade e população. No oitavo dia (cinco dias as larvas de idade), a população de larvas é diluída a partir de 1 bandeja para ~ 10 bandejas, com uma pitada de alimentos A e dois comprimidos de C alimentos em cada bandeja. (~ 30 mins)

DIAS 9-12:

1. As larvas são alimentados todos os dias com alimentos C. No 12 º dia (9 larvas dias de idade), a água é trocada com água fresca e alimento é adicionado (uma pitada de alimentos B e dois comprimidos de comida C). As pupas começa a desenvolver nesta fase. As bandejas são cobertas com redes para evitar a fuga dos adultos. (~ 8-10 minutos)

DIA 13 - 15:

As pupas podem surgir para os adultos para os próximos 2 - 3 dias. O alimento é dado todos os dias para as larvas / pupas, removendo cuidadosamente o líquido para evitar a fuga dos adultos.

DIA 16:

1. Os adultos são coletados em uma gaiola por meio de um aspirador ligado à vácuo. A gaiola é composto por uma garrafa pequena ml 100 com um chumaço de algodão que é encharcada com sacarose 10% (autoclavado) e um forro de papel toalha no fundo para absorver todos os derramamentos de açúcar em potencial que podem ocorrer durante o manuseio gaiola. (~ 30-40 minutos)

DIA 17-21:

1. Os adultos (machos e fêmeas) são então mantidos na sala de insetário por 4-5 dias, alimentados com sacarose 10% antes de serem novamente sangue-fed para iniciar o próximo ciclo. Os mosquitos mesmo pode ser usado para desovar mais de uma vez.
2. Os mosquitos que não são necessários para a criação de experiências ou pode ser morto por colocar a gaiola em um freezer. As bandejas usadas e gaiolas devem ser limpas e secas antes de serem utilizados novamente.

NOTA: Pode haver algumas variações no método de criação do mosquito e laboratórios diferentes podem ter diferentes técnicas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Alimento A		Aquaricare		Alimento moído para peixes. Deve-se adicionar uma pequena pitada.
Alimento B		Purina		Alimento moído para gatos. Deve-se adicionar uma pequena pitada.
Alimento C		Purina		Alimento para gatos. Devem-se adicionar duas comprimidos.
RBC				células vermelhas do sangue preparadas: 40% de hematócrito em soro humano
RPMI	Meio
CPD				anticoagulante
soro				soro humano O+
Alimentador de mosquitos
parafilm
Anopheles gambiae				mosquitos
sacarose 10%				alimento para mosquitos
insetário