Summary
このプロトコルはノックアウトSRの凍結保存培地でヒトiPS細胞をcryopreserving、完全ノックアウトSRフィーダーフリー（KSR - FF）培地やフィーダーベースのノックアウトSR培地でこれらの細胞を回収するための詳細な手順を説明します。
Abstract
ヒトとマウスの線維芽細胞は、胚性幹細胞に非常に似て資質と1月3日 iPS細胞を生成するために再プログラムできることを2006年の発見は、創薬、細胞治療、および基礎研究のための多能性細胞の貴重な新しいソースを作成しました。
GIBCOの培地および試薬は、年間の多能性幹細胞研究の最前線にされている。 DMEMはノックアウト血清代替物を添加したノックアウトは胚性幹細胞の成長と現在のiPS細胞培養3-9最適なメディアです。この金の標準的なメディアシステムは、現在、ノックアウトSRの成長因子のカクテルを追加してフィーダーを含まない培養に使用することができます。
従来のヒトESやiPS細胞の培養法はマウスやヒトの線維芽細胞フィーダー層の使用、またはフィーダ-馴化培地を必要とする。これらの培養法は、スケールにハード、労働集約的であり、それが原因で未定義の条件に未分化腰の細胞を維持することは困難である。インビトロジェンでは、フィーダーフリーへの移行はお尻とhES細胞の培養を、まだノックアウトSRの使用を維持しながら簡単にできるように、ノックアウトSRの成長因子のカクテルを開発しました。
Protocol
注：無菌培養条件を維持するためには、このプロトコルの手順のすべては、無菌室の安全基準を用いて実施し、層流フードの下に行われている。
開始する前に、すべてのメディアは℃、適切にガス処刑37に平衡であることを確認してください。
Geltrexコーティングした培養皿の準備
注：CELLstartコート培養皿を使用するための付録を参照してください。
- 2〜8雪解けGeltrexの一管（1mL）をゆっくり° CとノックアウトD-MEM/F-12の99 mLので1:100にそれを希釈する。穏やかに解決策を混ぜる。
注：一部のiPS細胞株は、最適な成長のための異なるGeltrexの希釈が必要な場合があります。代替希釈については、付録を参照してください。 - Geltrex溶液（35 - mmディッシュに1 mLを、60 mmディッシュでは1.5 mL）でそれぞれ培養皿の表面全体をカバーしています。
- 乾燥を防ぎ、37℃で1時間のための皿をインキュベートするためにパラフィルムで各皿をシール℃に
注：最大1ヶ月間この時点では、4℃でGeltrexコーティングした培養皿が格納されることがあります。乾燥からGeltrexを防ぐためパラフィルムで各皿をシール。 - 使用する前に、層流フードへGeltrex -コートディッシュを転送し、それらが室温（約1時間）に平衡化することができます。
完全ノックアウトSRフィーダーを含まない培地を準備
- 10μg/ mLの基本的なFGFの溶液1 mLを準備するには、無菌的に以下のコンポーネントを混在させること。 -20℃で分注しソリューションと店舗までの6ヶ月間。
塩基性FGF 10μgの D - PBS 990μL 10％BSA 10μL
注：BSAは、同じ濃度でHSAまたはノックアウトSRで置換することができます。 - 2 mg / mLのディスパーゼの溶液50mlを準備するには、無菌的に以下のコンポーネントを混在させること。 4の解と店舗℃で2週間までを滅菌フィルタします。
ディスパーゼ 100mgの D - PBS 50 mLの - 完全なノックアウトSRフィーダーフリー（KSR - FF）100mLを準備するには無菌的に以下の表に記載されているコンポーネントを組み合わせる。
コンポーネント ストック濃度 最終濃度 ボリューム ノックアウトDMEM/F12（カタログ番号。12660〜012） - 1X 76.8 mLの グルタミン- I（製品番号35050〜061） 200mMの 2mMの 1 mLの ノックアウトSR（カタログ番号。10828〜028） - 20パーセント 20 mLの ノックアウトSR - GFC（カタログ番号。A10580 - 01） 50X 1X 2 mLの bFGFの（カタログ番号。PHG0024）。 10μg/ mLの 20 ng / mLの 200μL
最大1週間までには2-8 ° CでKSR - FF媒体を格納することがあります。 - 温度とガスに完全培地を事前に平衡化する直前に、無菌的に0.1mMの最終濃度は2 -メルカプトエタノールの必要量 （55 mMストック濃度）を追加します 。例えば、KSR - F 100mLを準備するFの培地は55 mM 2 - メルカプトエタノール（1:550希釈）182μLを加える代わりに、2 - メルカプトエタノールは、1X完了培地に添加し、2〜8℃で1週間までのCで保存することができます。
凍結/凍結保存培地の準備
凍結保存培地は2つのメディアから構成され、彼らは別々のタイミングで細胞に添加され、分離されたままにしておく必要があります凍結培地及び凍結培地のB.。彼らは、それぞれの凍結保存媒体の総容積の50％が必要とされています。必要に応じて凍結保存媒体の総体積は、フリーズしたように各バイアルに1 mLです。ヒトES細胞の90％コンフルエント60ミリメートル皿は凍結保存媒体でヒトES細胞のバンク2バイアルに使用することができます。
超過を確実にするために付加的な2 - 5mLを使用して各凍結培地の十分なボリュームを準備します。
| 凍結培地（最終容量の50％）： | 50パーセントDMEM/F12 | 50％のKSR |
| 凍結培地B（最終容量の50％）： | 80パーセントDMEM/F12 | 20％DMSO |
例：
あなたが細胞の20バイアルを凍結している場合は、凍結保存培地の20mlのが必要になります。 24mL凍結保存培地の合計のために超過分を4mlのを追加。それはあなたが凍結培地（24mLの50％）および凍結培地Bの12mL（24mLの50％）の12mL必要があることを意味します。
| 凍結培地（12 mL）中： | 6 mLのDMEM/F12 | 6 mLのKSR |
| 凍結培地B（12 mL）中： | 9.6 mLのDMEM/F12 | 2.4mLのDMSO |
凍結保存培地の最終組成は65％DMEM/F12、25％KSR、および10％DMSOである。
Cryopreserving性IPSC
- 37℃の水浴中でディスパーゼのプレ暖かい必要なボリューム。必要なボリュームの詳細については、下記の表1を参照してください。
- 37℃の水浴で15分間でKSR - FFの必要量を事前に平衡化します。必要なボリュームの詳細については、表の1belowを参照してください。
- ピペットを用いて培養容器から使用済み培地を吸引し、そしてD - PBSで細胞を2回すすいでください。
- ゆっくりと培養容器（例えば、60 mmの培養皿あたりのディスパーゼ溶液1 mL）に予め温めておいたディスパーゼのソリューションを追加します。コート全体の細胞表面をにスワール培養容器を。
- 3分間37℃で培養容器をインキュベートする。
- インキュベーターから容器を削除、ディスパーゼソリューションを吸引し、そして穏やかに、D - PBSで細胞を洗浄する。
- 優しくセルスクレイパーを用いて培養皿の表面から細胞をこすり、および滅菌15mlの遠心チューブに細胞を移す。
- 静かに切り離されていない任意のセルを"オフ噴霧"、KSR - FFで二回培養皿をすすぎます。プールは、15mlのチューブで細胞と培地を洗い流してください。
- ペレットに室温で5分間、細胞を200 xgでチューブを遠心分離します。
- 慎重に細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引し、それを捨てる。
- cryovialsの十分な量を準備します。細胞はDMSOと接触していると、彼らは2〜3分以内に分注し、凍結して下さい。
- ゆっくりと完全に[穏やかに5 mLの血清学的ピペットを使用して上下にピペッティングして]を凍結培地Aにチューブの底からの細胞ペレットと再サスペンド細胞を取り除くために、チューブをフリック。穏やかに混合して細胞懸濁液を渦巻くながら、塊の均一な懸濁液に続いて、、滴下方法で、それに凍結培地Bの等量を追加します。
注：この時点で、細胞はDMSOと接触している、と作業が効率的に実行する必要があります。いったん細胞はDMSOと接触している、それらは2〜3分以内に分注し、凍結して下さい。 - 各クライオバイアルに細胞懸濁液のアリコートを1ミリリットル。
- ℃で一晩迅速ミスターフロスティでバイアルを配置[急速に凍結する]、-80に転送します。
- -80℃で一晩保管° Cの後、長期保管のための液体窒素タンクにセルを転送する。
IPSCバイアルの雪解けと細胞の回復
注：KSR - FFは、KSR含有MEF -馴化培地、またはフィーダで使用するためのKSRの培地で置き換えられるかもしれません。メディアを準備するための指示については、付録を参照してください。
50 mlチューブにKSR - FF媒体のプレ暖かい10mLを。
- ちょうどあなたのめっき前に室温にGeltrex - コートディッシュの適切な量を平衡化し、皿から液体を吸引するR細胞。
- 慎重にヒトES細胞（またはIPSC）液体窒素貯蔵タンクからバイアルを取り外してください。
- ちょうど小さな冷凍チャンクがバイアルになるまで急速に、37 ° Cの水浴中で細胞の凍結バイアルを解凍。
- それを除染し、無菌組織培養フードにそれを転送するためにイソプロパノール70％スプレーバイアル。
- 無菌的に5 mLのピペットを用いて15 mLコニカルチューブにバイアルの内容全体を転送する。
- KSR - FF 1 mlのバイアルをリンスし、15 mlの遠心チューブに以下を追加。
- ゆっくりと、KSR - FFの4 mLの15mlのコニカルチューブに細胞に滴下して加える。培地を添加しながら、穏やかに細胞を混合する前後にチューブを移動します。 （これは細胞に浸透圧ショックを減らす）。
- 室温で2分間1000rpm（200 × g）で細胞懸濁液を15 mLの試験管を遠心します。
- 慎重に吸引し、細胞ペレットを乱すことなく、上清を捨てます。
- 5 mLのピペットを用いて予め温めておいたKSR - FF（例えば4mL/60 mmディッシュ）で細胞ペレットを再サスペンドし、細胞ペレットが完全に分散されるまで静かに上下のセルをピペッティング。生存率が70％未満の場合は70％を超えるの生存率が期待されている、しかし、それは、コンフルエントに達するために、細胞のために時間がかかることがあります。
- 同じピペットを使用して、細胞懸濁液を室温に平衡化Geltrexコーティングした培養皿に滴下して転送する。
- 空気中の4〜6％CO 2の加湿雰囲気下で、37℃インキュベーターで培養皿を置きます。均等に細胞を分散させる西側パターンに南、東、北に慎重にスワール容器。
- 静かに培養皿24時間の解凍後、細胞破片を除去すると料理が約70〜80％コンフルエントになるまで、新鮮な栄養素を提供するために、その後毎日流体変更。あなたのiPS細胞の継続的な文化と継代については、"完全ノックアウト血清代替フィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のフィーダーフリー培養と継代"というタイトルの我々のプロトコルを参照してください。
予想される結果
細胞は、前の凍結保存にコンフルエントおよそ70から80パーセントにする必要があります。アップカーリングとコロニーの縁に沿ってコロニーの折り畳みのディスパーゼの消化は結果。細胞を収穫した後、彼らは、凍結保存メディアの小さな塊として凍結されています。バイアルを融解されると、細胞が回復し、小さな塊としてプレコートしたディッシュに付着する。彼らは急速に5-6日でコンフルエント皿につながる成長する。
表1 - 推奨ボリューム
| コンポーネント | 35mmのディッシュ | 60ミリメートルディッシュ | 100mmディッシュ |
| 完全にノックアウトSR培地 | 2 mLの | 4 mLの | 10mLの |
| Geltrexソリューション | 1 mLの | 1.5 mLの | 4〜5 mLの |
| ディスパーゼ | 0.5mLの | 1 mLの | 3〜4 mLの |
| すすぎのためのD - PBS | 2 mLの | 4 mLの | 10mLの |
してください付録を見るにはここをクリック 。
Disclosures
この記事の著者は、この記事で使用した試薬と器具を生産Life Technologies社によって採用されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM/F12 | 12660-012 | Note: see appendix for the use of alternative DMEM products GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061) | |
| KnockOut Serum Replacement | 10828-028 | ||
| KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail | A10580-01 | ||
| FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg | PHG0024 | Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes. | |
| 2-Mercapt–thanol | 21985-023 | ||
| Dispase | 17105-041 | Note: see appendix for alternative passaging methods | |
| Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL | A10480-01 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium | 14190-144 | ||
| DMSO, 500mL | JT Baker | JT9224-1 | |
| Sterile Tissue Culture Hood | |||
| Incubator set at 37°C | |||
| Pipette-Aid | |||
| Water Bath set at 37°C | |||
| Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL) | |||
| Centrifuge | |||
| 15 mL centrifuge tubes | |||
| 60 mm Tissue Culture treated dishes | |||
| Liquid nitrogen storage tank | |||
| Isopropanol freezing containers | |||
| 1.5 mL Cryovials |
References
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- Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
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