Summary
Bu protokol nakavt SR kriyoprezervasyon orta insan iPS hücreleri dondurularak ve bu hücrelerin tam nakavt SR Besleyici Ücretsiz (KSR-FF), orta ya da besleyici tabanlı nakavt SR orta kurtarmak için ayrıntılı prosedürü anlatılmaktadır.
Abstract
2006 yılında, insan ve fare fibroblastlar dikkat çekici embriyonik kök hücrelere benzer nitelikleri ile 1-3 iPS hücreleri üretmek yeniden olabilir keşif pluripotent hücrelerin hücre tedavisi, ilaç keşfi ve temel araştırmalar için değerli bir yeni kaynak yaratmıştır .
Gibco medya ve reaktifler yıllardır pluripotent kök hücre araştırmaları ön planda olmuştur. DMEM Nakavt Nakavt Serum Değiştirme ile desteklenmiş, embriyonik kök hücre büyümesi ve şimdi iPS hücre kültürü 3-9 için tercih edilen medya . Bu altın standart medya sistemi artık Nakavt SR Büyüme Faktörü Kokteyli ilavesi ile besleyici ücretsiz kültür kullanılabilir.
Geleneksel insan ES ve iPS hücre kültürü yöntemleri, fare veya insan fibroblast besleyici katmanları veya besleyici klimalı ortamı gerektirir. Bu kültür yöntemleri ölçekli, emek-yoğun, sert ve tanımlanmamış durumlar nedeniyle farklılaşmamış kalça hücreleri korumak için zordur. Invitrogen Nakavt SR hala korurken, kalça ve embriyonik kök hücre kültürlerinde kolaylıkla geçiş için besleyici ücretsiz izin Nakavt SR Büyüme Faktörü Kokteyl geliştirdi.
Protocol
Not: steril kültür koşullarını korumak için, bu protokol tüm prosedürlerin steril laboratuar uygulamaları kullanılarak gerçekleştirilen ve laminer akış kaputu altında yürütülmelidir.
Başlamadan önce, herhangi bir ortam, 37 dengelenmiş olduğundan emin ° C ve uygun gazladı.
Geltrex kaplı Kültür Yemekleri hazırlanması
Not: CELLstart kaplı kültür kaplarına kullanmak için eke bakınız.
- Çözülme Geltrex yavaş yavaş 2-8 (1 mL) ° C tüp ve Knockout D-MEM/F-12 99 ml 1:100 onu sulandırmak. Çözüm hafifçe karıştırın.
Not: Bazı iPS hücre hatları, optimum büyüme için farklı bir Geltrex seyreltme gerekebilir. Alternatif dilüsyonları için eke bakınız. - Her kültürün çanak tüm yüzeyi Geltrex çözüm (35 mm yemek için 1 ml, 60 mm yemek için 1.5 ml) ile kaplayın.
- Kurumasını önlemek ve 37 yemekleri az 1 saat inkübe Parafilm ° C ile her tabak sızıntısını önleyiniz
Not: Bu noktada, 1 aya kadar 4 ° C'de Geltrex kaplı kültür kaplarına saklayabilir. Geltrex kurumasını önlemek için her tabak Parafilm Seal. - Kullanmadan önce, bir laminer akış kaputu Geltrex kaplı yemekler aktarmak ve onları oda sıcaklığında (yaklaşık 1 saat) gelmesini sağlar.
Komple nakavt SR Besleyici Ücretsiz Orta hazırlanması
- 10 mcg / ml Temel FGF çözüm, 1 ml hazırlamak için, aseptik aşağıda listelenen bileşenleri karıştırın. -20 ° C'de kısım çözüm ve mağaza, 6 aya kadar.
Temel FGF 10 mikrogram D-PBS 990μL 10% BSA 10 mcL
Not: BSA aynı konsantrasyonda HSA veya Knockout SR ile ikame edilebilir. - 50 ml 2 mg / ml Dispase çözüm hazırlamak için, aseptik aşağıda listelenen bileşenleri karıştırın. Filtre 4 çözüm ve mağaza ° C 2 haftaya kadar sterilize.
Dispase 100 mg D-PBS 50 ml - Besleyici-Free (KSR-FF) Tam nakavt SR 100 mL hazırlamak için aseptik aşağıdaki tabloda listelenen bileşenleri birleştirmek.
Bileşen Stok Konsantrasyon Final Konsantrasyon Hacim Nakavt DMEM/F12 (Kat. No. 12.660-012) - 1X 76.8 ml GlutaMAX-I (Kat. No: 35.050-061) 200 mm 2 mM 1 ml Nakavt SR (Kat. no: 10.828-028) - % 20 20 ml Nakavt SR-GFC (Kat. no. A10580-01) 50X 1X 2 mL bFGF (Kat. No. PHG0024). 10 mcg / mL 20 ng / ml 200 mcL
Bir haftaya kadar 2-8 ° C'de KSR-FF orta saklayabilir. - Sıcaklık ve gazlar için tam orta pre-değişikti hemen önce, aseptik 0.1 mM son konsantrasyon için gerekli 2 merkaptoetanol hacmi (55 mM stok konsantrasyonu) ekleyin. Örneğin, 100 ml KSR-F hazırlamak içinF orta, 2-mercaptoethanol (1:550 dilüsyon) Alternatif olarak 55 mM 182 mcL eklemek, 2-merkaptoetanol 1X tamamlanan orta eklenir ve bir haftaya kadar 2-8 ° C'de muhafaza edilebilir.
Donma / Kriyoprezervasyon Orta hazırlanması
Kriyoprezervasyon orta iki ortam oluşur; Donma Orta ve Donma Orta B. farklı zamanlarda hücreleri eklenir ve kalır ayrılmalıdır. Her Kriyoprezervasyon Orta toplam hacminin% 50 ihtiyaç vardır. Donmuş gibi her flakon için gerekli Kriyoprezervasyon Orta toplam hacim 1 ml. HESC% 90 konfluent 60mm çanak hESC banka 2 şişeleri kriyoprezervasyon medya için kullanılabilir.
Tutarı düşmek sağlamak için ekstra 2-5ml her Donma Orta yeterli hacmi hazırlayın.
| Donma Orta A (son hacmi% 50): | 50% DMEM/F12 | 50% KSR |
| Donma Orta B (son hacmi% 50): | 80% DMEM/F12 | % 20 DMSO |
Örnek:
20 şişeleri hücre dondurma iseniz, Kriyoprezervasyon Orta 20ml gerekecektir. 24mL Kriyoprezervasyon Orta toplam tutarı düşmek için 4ml ekleyin. Donma Orta 12ml gerekecektir anlamına gelir (24mL% 50) ve Donma Orta B (24mL% 50), 12ml.
| Donma Orta A (12 ml): | 6 ml DMEM/F12 | 6 ml KSR |
| Donma Orta B (12 ml): | 9.6 mL DMEM/F12 | 2.4 mL DMSO |
Kriyoprezervasyon Orta nihai bileşimi% 65 DMEM/F12,% 25 KSR, ve% 10 DMSO.
Dondurularak iPSCs
- 37 ° C su banyosunda Dispase Öncesi sıcak gerekli hacim. Gerekli miktarlar hakkında ayrıntılı bilgi için aşağıdaki Tablo 1'e bakınız.
- 37 ° C su banyosunda for15 dakika KSR-FF gerekli hacmi Pre-dengelenmesi. Tablo 1below gerekli miktarlar hakkında ayrıntılı bilgi için bakınız.
- Bir pipet kullanarak kültür damarı harcanan orta aspire ve hücrelerin D-PBS ile iki kez yıkayın.
- Yavaşça kültür damarı (örneğin, 60 mm kültür çanak başına Dispase çözüm 1 ml) önceden ısıtılmış Dispase çözüm ekleyin. Tüm hücre yüzeyinde kat Swirl kültür damarı.
- Kültür damarı 3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Inkübatör geminin çıkarın, Dispase çözüm aspirat ve D-PBS ile hücrelerin nazikçe yıkayın.
- Hücrelerin, hücre kazıyıcı kullanarak kültürü çanak yüzeyinden hafifçe kazıyın ve 15 mL steril bir santrifüj tüpüne hücreleri aktarmak.
- Nazikçe müstakil olmayan herhangi bir hücre "püskürtme", KSR-FF ile iki kez kültür çanak durulayın Havuz, 15 mL tüp hücreleri orta durulayın.
- Tüp, oda sıcaklığında pelet hücreleri 5 dakika boyunca 200 xg'de santrifüjleyin.
- Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatantı aspirat ve atın.
- Cryovials yeterli miktarda hazırlayın. Hücreleri DMSO ile temas edildikten sonra, onlar aliquoted ve 2-3 dakika içinde dondurulmuş olmalıdır.
- Yavaşça tam [tüp alttan hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme 5 ml serolojik pipet kullanarak] hücre pelletini yerinden ve Donma Orta A. hücreleri yeniden askıya tüp fiske. Hafifçe karıştırın hücre süspansiyonu dönen kümeleri tek tip süspansiyon ardından, bir damla akıllıca bir şekilde, eşit miktarda Donma Orta B ekleyin.
Not: Bu noktada, hücrelerin DMSO ile temas ve çalışma verimli bir şekilde yapılmalıdır. Hücreleri DMSO ile temas edildikten sonra, onlar aliquoted ve 2-3 dakika içinde dondurulmuş olmalıdır. - Her cryovial hücre süspansiyonu kısım 1 ml.
- Hızla [hızla dondurma] Mr Frosty şişeleri yer ve -80 ° C gecede transfer.
- ° C - -80 geceleme depolama sonra, uzun süreli depolama için bir sıvı nitrojen tankı hücreleri aktarmak.
iPSC flakon çözülme ve hücre kurtarma
Not: KSR-FF KSR-MEF-klimalı içeren orta veya besleyiciler ile kullanmak için KSR orta ile değiştirilebilir. Medya hazırlanması için talimatlar için eke bakınız.
KSR-FF orta Pre-sıcak 10 ml, 50 ml tüp içinde.
- Geltrex kaplı yemekler sadece kaplama önce oda sıcaklığına uygun miktar dengelenmesi ve yemeklerinden herhangi bir sıvı aspirer hücreleri.
- HESC Sıvı Azot Depolama Tankı (veya iPSC) flakon dikkatlice çıkarın.
- Sadece küçük bir dondurulmuş yığın flakon kalana kadar hızla 37 ° C su banyosunda hücreler dondurulmuş flakon Çözülme.
- % 70 ile dekontamine ve steril doku kültürü kaputu transfer izopropanol flakon Sprey.
- Aseptik olarak 5 ml pipet kullanarak 15 ml konik bir tüp içine flakon tüm içeriğini aktarmak.
- KSR-FF 1 ml Flakon durulayın ve 15 ml santrifüj tüpüne ekleyin.
- Yavaşça, KSR-FF 4 mL, 15 mL konik tüp hücrelerin damla-bilge ekleyin. Orta eklerken, hücreler hafifçe karıştırın tüp ileri ve geri hareket ettirin. (Bu hücrelerin ozmotik şok azaltır).
- 15 ml tüp, oda sıcaklığında 2 dakika 1000rpm (200 x g) hücre süspansiyonu ile santrifüjleyin .
- Dikkatlice aspire ve hücre pelletini bozmadan süpernatantı atın.
- Önceden ısıtılmış KSR-FF hücre pelet (örneğin 4mL/60 mm çanak) 5 ml pipet kullanarak hücrelerin hücre pelletini tamamen dağınık olduğu kadar yavaşça yukarı aşağı pipet ve yeniden askıya aldı. Canlılığı% 70'den az ise% 70 daha fazla bir canlılığı bekleniyor, ancak, bu hücreler için izdiham ulaşmak için daha uzun sürebilir.
- Aynı pipet kullanarak, hücre süspansiyonu oda sıcaklığında ön dengelenmiş Geltrex kaplı kültürü çanak açılır akıllıca aktarın.
- Havada% 4 ila 6 CO 2 nemlendirilmiş bir atmosfer ile 37 ° C inkübatör kültür çanak yerleştirin. Kuzey güney, doğu batı desen hücreler eşit olarak dağıtmak için dikkatlice girdap gemi.
- Yavaşça kültür tabak sıvı değiştirmek için 24 saat sonrası çözülme ve hücre enkaz kaldırmak için ve bundan sonra çanak konfluent yaklaşık% 70-80 kadar taze besin sağlamak için günlük. IPS hücreleri devam eden kültür ve Pasajlanması için, "İnsan iPS Hücreler Komple nakavt Serum Yedek kullanarak Besleyici Ücretsiz Kültür ve Pasajlanması Besleyici-Alerjik Orta" başlıklı protokol bakın
Beklenen Sonuçlar
Hücreleri önce kriyoprezervasyon konfluent kabaca% 70-80 olmalıdır. Kıvrık ve koloni kenarları boyunca koloniler katlayarak sindirim sonuçları Dispase. Sonra hasat hücrelerin dondurulması medyada küçük kümeleri olarak dondurulur. Flakon çözülmüş sonra, hücreler kurtarmak ve küçük kümeleri olarak önceden kaplı çanak eklemek. Bunlar hızla konfluent 5-6 gün içinde bir çanak lider büyür.
Tablo 1 - Önerilen Hacimleri
| Bileşen | 35mm Bulaşık | 60mm Bulaşık | 100mm Bulaşık |
| Komple nakavt SR orta | 2 mL | 4 mL | 10 ml |
| Geltrex Çözüm | 1 ml | 1,5 mL | 4-5 ml |
| Dispase | 0,5 mL | 1 ml | 3-4 ml |
| Durulama için D-PBS | 2 mL | 4 mL | 10 ml |
Lütfen ek görmek için tıklayınız .
Disclosures
Bu makalenin yazarları, bu yazıda kullanılan reaktifler ve aletleri üreten Life Teknolojileri tarafından istihdam edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM/F12 | 12660-012 | Note: see appendix for the use of alternative DMEM products GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061) | |
| KnockOut Serum Replacement | 10828-028 | ||
| KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail | A10580-01 | ||
| FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg | PHG0024 | Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes. | |
| 2-Mercapt–thanol | 21985-023 | ||
| Dispase | 17105-041 | Note: see appendix for alternative passaging methods | |
| Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL | A10480-01 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium | 14190-144 | ||
| DMSO, 500mL | JT Baker | JT9224-1 | |
| Sterile Tissue Culture Hood | |||
| Incubator set at 37°C | |||
| Pipette-Aid | |||
| Water Bath set at 37°C | |||
| Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL) | |||
| Centrifuge | |||
| 15 mL centrifuge tubes | |||
| 60 mm Tissue Culture treated dishes | |||
| Liquid nitrogen storage tank | |||
| Isopropanol freezing containers | |||
| 1.5 mL Cryovials |
References
- Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Maherali, N. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).
- Li, W. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
- Liao, J. Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells. Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).
- Dimos, J. T. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321, 1218-1221 (2008).
- Aasen, T. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).
- Park, I. H. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).
