Muitas infecções provocar uma forte resposta CTL, mas, ocasionalmente, a quantidade de células que respondem não se relaciona com o controle do patógeno 1. Uma medida da qualidade do CTL é a sua capacidade de matar especificamente 2. Rotulagem CFSE de células-alvo pode ser usado para investigar esta qualidade de resposta CTL In vivo 3,4.
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Artigo de método
Specific Antigen In Vivo Ensaio Killing usando células CFSE rotuladas Alvo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Diacetato carboxifluoresceína succinimidyl éster (CFSE) pode ser usado para facilmente e rapidamente rótulo uma população de células de interesse para a investigação in vivo. Esta rotulagem tem sido classicamente utilizado para o estudo da proliferação e migração. No método aqui apresentado, temos reduzido o cronograma, após a transferência adotiva de olhar para a sobrevivência e morte de epítopo específico CFSE células-alvo marcado 4-6. O nível de matar específica de um clone de células T CD8 + pode indicar a qualidade da resposta, como a sua quantidade pode ser enganosa. Específicos células T CD8 + podem se tornar funcionalmente esgotado ao longo do tempo com um declínio na produção de citocinas e matando 7,8. Além disso, certos CD8 + clones de células T não pode matar, bem como outros com diferentes especificidades TCR 9. Eficazes para Imunidade mediada por células (CMI), os antígenos devem ser identificados que produzem não apenas um número adequado de células T responder, mas também funcionalmente robusta células T responder. Aqui nós avaliamos a morte de células específicas de dois por cento peptídeo clones específicos de células T em camundongos BALB / c.
Protocolo
1. Provocando destino-específico CTLs efetoras de Imunização (Dia 0)
- Antes de começar, decida em cima de um efetor específicos: sistema de destino. Neste exemplo de um clássico ensaio in vivo de CTL, usaremos uma imunização peptídeo purificado para provocar específicas CD8 + T células. O peptídeo mesma será usada para pulso as células-alvo singênico, criando um efetor específicos: sistema de destino. Alternativamente, você pode optar por utilizar patógeno todo ou proteínas para obter o seu efetores e metas específicas.
- Descontaminar a superfície de trabalho dentro de uma capa de biossegurança para garantir a esterilidade das injeções. Pr....
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Discussão
Este ensaio pode ser modificado para investigar a capacidade proliferativa das células, incluindo a expansão clonal, porque CFSE relativamente divide igualmente entre os descendentes 10,11. Também é possível usar rotulagem CFSE para investigar a migração celular 6,12, embora existam outras células rastreamento métodos que podem ser mais apropriadas dependendo da hipótese, por exemplo tetrâmeros e bioluminescência 13, que também pode ser combinado com rotulagem CFSE.
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados. Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Institutional Animal Care e do Comitê de Uso (IACUC) da Universidade de Wisconsin-Madison.
Agradecimentos
Gostaria de agradecer a Bianca Mothé, Carla Oseroff, e Marie-France DelGuercio por me apresentar ensaios imunológicos e manuseio do mouse. Trabalho no laboratório de GA Splitter é financiado pelo NIH conceder 1-RO1-AI-073558, GLRCE conceder 1-U54-AI-057153, e BARD EUA-3829-06.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| esferas de vidro de 1 mm | Biospec Products | 11079110 | |
| 70 μpeneira de células M | BD Biosciences | 352350 | |
| placa de 96 poços | Costar | 3799 | |
| Adjuvante Incompleto de Freund’s Adjuvante | Pacific Immunology | n/a | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| SFB | GIBCO, da Life Technologies | 16000-077 | |
| Citómetro de Fluxo FC 500 | Beckman Coulter Inc. | n/a | |
| Moedor de tecidos de vidro Kontes | Kontes Corp | 885300-0015 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | |
| Agulha | BD Biosciences | 305175 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | |
| Paraformaldeído | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| PBS | GIBCO, da Life Technologies | 10010-023 | |
| Reagente lisante PharmLyse | BD Biosciences | 555899 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, da Life Technologies | 11875-093 | |
| Seringa | BD Biosciences | 309602 | |
| Vybrant CFSE Kit | Invitrogen | V12883 |
Referências
- Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
- Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M.
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Reimpressões e permissões
