Colon ascendens Stent peritonite (CASP) - um modelo padronizado para sepse abdominal polimicrobianas

Resumo

O Colon ascendens Stent peritonite (CASP) é um modelo altamente padronizado para sepse abdominal polimicrobianas em roedores. Este artigo descreve o procedimento cirúrgico de CASP. O modelo CASP e suas variantes permitem a investigação sistemática de vários problemas a respeito do assunto da sepse.

Resumo

Sepse continua sendo um problema persistente em unidades de terapia intensiva em todo o mundo. Compreensão dos mecanismos complexos da sepse é a condição prévia para o estabelecimento de novas abordagens terapêuticas nesta área. Portanto, os modelos animais são necessários que são capazes de mimetizar a doença humana e também suficientemente lidar com questões científicas. O Colon ascendens Stent peritonite (CASP) é um modelo altamente padronizado para sepse abdominal polimicrobianas em roedores. Neste modelo, um stent de pequeno porte é cirurgicamente inserido no cólon ascendente de camundongos ou ratos levando a um vazamento contínuo de bactérias intestinais na cavidade peritoneal. O procedimento resulta em bacteremia, peritonite sistêmica, infecção por bactérias do intestino de órgãos e liberação sistêmica, mas também locais de diversas citocinas pró e anti-inflamatório. A letalidade da CASP pode ser controlado pelo diâmetro do stent inserido. Uma variante deste modelo, o CASP chamados com a intervenção (Caspi), levanta oportunidade para remover o foco séptico por uma segunda operação de acordo com procedimentos comuns na prática clínica. CASP é um modelo facilmente aprendida e altamente reprodutível, que imita o curso clínico da sepse abdominal. Ele leva jeito para o estudo sobre as questões em vários campos científicos, por exemplo imunologia, Infecciologia, ou cirurgia.

Protocolo

1. Preparação do Rato

1. Anestesiar o rato por injeção intraperitoneal do fluido narcóticos (ver tabela de reagentes) e colocá-lo na posição supina.
2. Os pés do mouse precisa ser fixada com fita na placa para assegurar uma posição estável do animal durante a operação.

2. Operação

1. Tome uma cânula iv, que é comumente usado para injeções iv em seres humanos, e esculpir seu tubo de plástico circularmente dois milímetros de sua ponta. Usamos três diferentes tamanhos de cânulas para controlar as taxas de mortalidade (BD Venflon 18GA (1,2 x45mm, 80 mL / min); 16GA (1,7 x45mm, 180 mL / min) 14GA (2,0 x45mm, 270 mL / min)).
2. Após a desinfecção completa da pele abdominal, inciso lo ao longo de sua linha média cerca de 15mm. Abrir a caverna peritoneal por incisão dos músculos abdominais e peritônio ao longo da linha alba.
3. Identificar o pólo cecal e retire cuidadosamente ceco, íleo terminal e cólon ascendente para fora do abdômen pelo uso de cotonetes.
4. 15 milímetros distal da válvula ileocecal, um tem que perfurar a parede do cólon ascendente com uma sutura 7 / 0. Assim, as lesões dos vasos do intestino tem que ser evitado. A sutura é fixa na parede do cólon por dois nós cirúrgicos.
5. Agora perfurar o cólon ascendente com o preparado cânula 1-2 mm proximal da sutura 7 / 0. Insira cuidadosamente a cânula no cólon até o sulco no tubo de plástico está em um nível com a serosa.
6. Coloque as extremidades livres da sutura 7 / 0 ao redor da cânula e colocar um nó duplo exatamente no sulco preparado do tubo de plástico.
7. Agora, pegue a agulha da sutura 7 / 0 e costurá-lo através da parede antimesentérica do cólon. Consecutivamente, dois nós cirúrgicos devem ser realizados adicionalmente fixar o tubo plástico na parede do cólon. Cortar as pontas de sutura.
8. Recuperar a parte de ferro da cânula um pouco e cortar o tubo de plástico fora perto (1mm) para a fixação 7 / 0 de sutura.
9. Agora é preciso cuidado leite fezes do ceco para o stent de cólon com o uso de cotonetes até uma pequena ponta de fezes aparece no topo do stent.
10. Coloque o intestino volta para a caverna peritoneal e reposição volêmica performe pela administração intraperitoneal de 0,5 mL de solução salina.
11. Fechar o peritônio com sutura contínua (4 / 0).
12. Feche a pele com suturas singular (4 / 0).

3. Cuidados no pós-operatório

1. Recolocar o animal em sua gaiola, que deve conter alimentos e água suficientes. Para analgesia, a administração intraperitoneal de uma substância poderosa analgésico (usamos buprenorfina) devem ser regularmente realizados.
2. Nos dois primeiros dias após a operação, a pessoa tem para controlar os animais a cada 6 horas.

4. Sham CASP

1. Execute as etapas de 1,1-2,4.
2. Não perfure o cólon. Basta executar os passos 2,6-2,8.
3. Execute as etapas de 2,10-3,2.

5. Caspi

1. Executar CASP usando uma cânula de 14G passos seguintes 1,1-3,1
2. 5h depois CASP, um tem de operar o animal novamente. Preparar e anestesiar o mouse novamente de acordo com as etapas 1,1-1,2
3. Abrir a sutura da parede abdominal.
4. Puxe o cólon ascendente com o stent inserido.
5. Corte cuidadosamente as suturas de fixação do stent e remover o stent.
6. Fechar o defeito no cólon, com suturas simples inversão (7 / 0).
7. Coloque o intestino volta para a cavidade abdominal e lave o último duas vezes com 10 mL de solução salina.
8. Fechar o peritônio com sutura contínua (4 / 0).
9. Feche a pele com suturas singular (4 / 0).
10. Siga os passos de 3,1-3,2

6. Resultados representante

Dentro de algumas horas após a operação, os animais apresentaram sinais clínicos de uma sepsis início. Os sintomas típicos da doença são reduzidas casaco mobilidade, eriçado, sudorese, diminuição da ingestão alimentar, perda de peso e comportamento de fuga também reduziu. Animais o desenvolvimento de uma peritonite grave com infecção sistêmica consecutivos normalmente morrem dentro de 48h. Dependendo do tamanho inserido stent, as taxas de mortalidade distintos podem ser gerados. A resultados 14G stent em 100% de mortalidade, 16G dá 70% de mortalidade, e as taxas de mortalidade de 50% pode ser alcançada usando um stent 18G (Figura 1a). O Sham operação resulta em uma taxa de sobrevivência de 100%. Normalmente, todos os animais morrem inbetween as primeiras 48 horas após CASP. Assim, todos os animais que estão vivos neste momento o tempo pode ser considerado como sobreviventes. No entanto, recomendamos um período de observação adicional de pelo menos 72 horas para detectar raro "óbitos tardios" depois CASP.

O resultado de Caspi depende do período de tempo após o CASP quando o stent é removido. Uma intervenção 3h após resultados CASP em uma taxa de sobrevivência de 45%. Se o stent é removido após 5h CASP, apenas 10% dosos animais sobreviver ao procedimento. A remoção do stent após os resultados 9h em uma mortalidade de 100% (Figura 1b). Sham Caspi leva a 100% de sobrevivência. Para as configurações de Caspi, recomendamos um período de observação de 10 dias, porque não são geralmente animais, que morrem mais tardar 48 horas após a CASP.

Inspeção macroscópica do abdominal situs 24 horas após CASP mostra sinais típicos de peritonite: edema, vasodilatação, parede do intestino eritematosa, demarcação nítida de placas de Peyer, paralisia intestinal, líquido livre, e secreção séptico (Figura 2).

A infecção sistêmica pode ser demonstrado por análises bacteriológicas. 12 horas após a CASP, enorme quantidade de bactérias pode ser detectada no lavado peritoneal, sangue, fígado, pulmão, baço e rins. Análise qualitativa de bactérias revela infecção sistêmica por bactérias intestinais típicos como E. coli, Bacteroides espécies, espécies de Enterococcus, etc (Figura 3).

CASP induzida por sepse se manifesta na liberação local e também sistêmica de citocinas pró e anti-inflamatórias e quimiocinas. 12 horas após CASP, quantidades significativas de TNF, IL-1β, IL-6, IL-10, MCP-1 e outros podem ser medidos por ELISA no sangue mas também nos sobrenadantes das suspensões de órgãos, o fígado, por exemplo, pulmão, baço, rins (Fig. 4).

Ao estabelecer CASP em seu laboratório, as taxas de sobrevivência, bacteriologia e liberação de citocinas devem ser tomados como parâmetros de controle para o desempenho correto do CASP. Mais tarde, estes parâmetros podem ser tomadas como padrão leu sistema para todas as configurações experimentais.

Figura 1a: A sobrevida após CASP. As taxas de sobrevida após a cirurgia CASP dependem do diâmetro do stent inserido. Resultados 14G CASP em uma taxa de mortalidade de 100%, os resultados CASP 16G na mortalidade de 70% e CASP 18G leva à mortalidade de 50%. Sham CASP está associada com uma sobrevida de 100%. . 20/group n = B: As taxas de sobrevida após a cirurgia Caspi dependem do tempo de remoção de stent. Remoção stent às 3h após 14G CASP leva a uma taxa de mortalidade de 55%. Remoção stent às 5h após 14G resultados CASP em uma taxa de mortalidade de 90%, enquanto a remoção stent às 9h, após resultados CASP 14G em 100% de mortalidade. Sham Caspi (5h) resulta em uma sobrevida de 100%. n = 10/group (Sham Caspi; Caspi 9h), n = 20/group (3h Caspi; Caspi 5h).

Figura 2: 24h Abdominal situs após CASP. A parede abdominal foi removido 24 horas após a 16G CASP ou CASP farsa, respectivamente. O situs do mouse sham operados olha fisiológicas. Em contraste, os resultados CASP em edema, hiperemia, intestinos dilatados e demarcação das placas de Peyer demonstrando grave peritonite.

Figura 3: Bacteriologia. CASP leva à infecção grave de vários compartimentos e órgãos por bactérias do intestino dentro de 12h após a operação. Número de bactérias são dadas como unidades formadoras de colônia (ufc) por mL, respectivamente. Culturas bacterianas tomadas de ratos sham operados são completamente estéreis (não mostrado). 16G CASP, n = 5/group.

Figura 4: As citocinas. CASP desencadeia uma resposta sistêmica do sistema imune como várias citocinas e quimiocinas são detectáveis ​​no plasma e também em sobrenadantes de órgãos. A figura mostra exemplarmente as citocinas pró-inflamatórias fator de necrose tumoral (TNF) e interleucina-6 (IL-6), bem como o predominantemente anti-inflamatórias IL-10. 12h após a CASP, os níveis notável pode ser detectado no plasma, fígado, pulmão, baço e. No entanto, IL-10 não pode ser detectado no pulmão e baço após CASP. Operação simulada não leva a qualquer secreção de citocinas (não mostrado). 16G CASP, n = 5/group.

Discussão

CASP é um modelo de sepse polimicrobiana abdominal que atende a maioria dos critérios postulados para um modelo de sepse valioso: CASP pode ser realizado em pequenos animais, é altamente reprodutível, fácil de monitorar através de parâmetros padrão, fornece boas possibilidades de ler, e imita situações clínicas de sepse abdominal. Em um estudo comparativo que pudéssemos mostrar que CASP leva a peritonite difusa com infecção precoce e de forma constante e inflamação sistêmica crescente (síndrome da resposta inflamatória sistêmica), enquanto a ligadura cecal e punção (CLP) revela um modelo de intra-abdominal com formação de abscesso sustentado e menores sinais de inflamação sistêmica (1). A técnica de Caspi apresenta a possibilidade de simular a evolução clínica da peritonite com saneamento foco consecutivos cirúrgica, que é o princípio mais importante terapêutica em humanos. CASP pode ser aplicada para todas as questões em torno de sepsis ou peritonite e, portanto, útil para todas as disciplinas que lidem com pesquisa sepse, por exemplo, imunologia, farmacologia, cirurgia, medicina intensiva, etc Uma seleção de publicações sobre diferentes temas de sepse usando o modelo CASP é dado abaixo (1-14).

Ao começar com a CASP, deve estar ciente de que alguma prática é necessária para executar a operação exatamente e rapidamente. Experiência cirúrgica pode ser útil mas não é necessário. Recomendamos detecção de letalidade como um parâmetro para o desempenho correto do CASP. Deve-se começar com CASP 14G como um stent grande é mais fácil de manusear do que um mais fino. Um cirurgião CASP treinado é capaz de operar um rato dentro de 10 minutos. Antes de iniciar qualquer experimento, você deve se certificar que você está perto esse período. Quando você ganha alguma experiência com o procedimento cirúrgico, você deve conduzir uma cinética de sobrevivência para verificar suas habilidades. 14G CASP deve resultar em uma letalidade de 100%. Iniciantes em nosso laboratório para provar que eles são capazes de gerar uma letalidade de 100% com CASP 14G antes de começar com experimentos. Além disso bacteriologia, e medidas de citocinas devem ser realizados para verificar a sepse. Se você tiver problemas no início com as etapas de microcirurgia da CASP, o uso de lentes de aumento ou um microscópio cirúrgico pode ser útil. Mas em princípio, CASP pode ser bem feita sem esses utilitários. Para a reprodução de nossas taxas de sobrevivência, é absolutamente necessário que os mesmos materiais, especialmente os stents (BD Venflon, veja abaixo), são utilizados. Caso contrário, as variações substanciais dos resultados são possíveis. Além disso, sugerimos que não pode haver variações dos resultados, dependendo, por exemplo, a individualidade do cirurgião. No entanto, a influência de fatores como o que deve ser pequena.

Em resumo, CASP é um praticável, modelo de sepse simples, reprodutível e valioso que imita de perto a situação clínica de sepse abdominal. É, portanto, adequado para todos os domínios da investigação sepse.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fluido narcótico			Misture 0,5 mL de Rompun com 4,0 mL de Ketanest e adicione 5,5 mL de solução salina (0,9%). Para anestesia completa, injete intraperitonealmente 10 μL/g de peso corporal
Rompun (20 mg/ml Xilazina)	Bayer AG
Ketanest (25mg/ml Esketamina)	Pfizer Pharma GmbH	647028001E
BD Venflon 18GA (1,2x45mm, 80ml/min)	BD Biosciences	391457
BD Venflon 16GA (1,7x45mm, 180ml/min)	BD Biosciences	391455
BD Venflon 14GA (2,0x45mm, 270ml/min)	BD Biosciences	391456
Catgut Poliéster 4/0 branco, não absorvível	Catgut GmbH	17218113
Mariderm preto 7/0, não absorvível	Catgut GmbH	18104900