Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce

Resumo

Este protocolo descreve uma abordagem adesivo baseados em fita simples para amostragem de tomate e outras superfícies de produtos frescos, seguido por detecção rápida de células toda a Salmonella Usando fluorescência In situ Hybridization (FISH).

Resumo

Este protocolo descreve um método simples para adesiva-fita baseada em amostragem de tomate e outras superfícies de produtos frescos, seguido em fita-hibridização fluorescente in situ (FISH) para detecção independente de cultura rápida de Salmonella spp. Fitas de células carregadas também podem ser colocados face para baixo em ágar seletivo para fase sólida de enriquecimento antes da detecção. Alternativamente, enriquecimentos de baixo volume de líquido (miniculture superfície do líquido) pode ser realizada sobre a superfície da fita em caldo não seletivo, seguido por FISH e análise através de citometria de fluxo. Para começar, fita adesiva estéril é colocada em contato com produtos frescos, uma leve pressão é aplicada, ea fita é removida, fisicamente extrair os micróbios presentes sobre estas superfícies. Fitas adesivas são montados lado-a em lâminas de vidro para microscópio e as células da amostra são fixados com formalina a 10% (30 min) e desidratados, utilizando uma série de etanol classificados (50, 80 e 95%; 3 min cada concentração). Em seguida, células carregadas fitas estão manchadas com tampão contendo uma Salmonella-alvo cocktail sonda de DNA e hibridização por 15 - 30 min a 55 ° C, seguido de uma breve lavagem em uma solução de lavagem para remover sonda não ligada. Aderente, FISH marcado células são então contrastado com o DNA de corante 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e os resultados são visualizados através de microscopia de fluorescência. Para o enriquecimento de fase sólida, célula carregada fitas são colocadas de face para baixo sobre uma superfície adequada agar seletivo e incubado para permitir o crescimento in situ de microcolônias Salmonella, seguido por FISH e microscopia, como descrito acima. Para miniculture superfície do líquido, células carregadas fitas são colocadas lado adesivo para cima e uma câmara de perfusão silicone é aplicado de modo que a fita eo formulário microscópio deslize a parte inferior de uma câmara estanque em que um pequeno volume (mL ≤ 500) de Trypticase Soy caldo (TSB) é introduzido. As portas de entrada estão fechados e as câmaras são incubadas a 35-37 ° C, permitindo o crescimento baseado em amplificação de fita-extraídos micróbios. Após a incubação, portas de entrada são selados, as células são separadas e misturadas com volta vigorosa e para trás pipetagem, colhidas através de centrifugação e fixados em 10% neutro tamponado. Finalmente, as amostras são cruzados e analisados ​​através de citometria de fluxo para revelar a presença de Salmonella spp. Como descrito aqui, o nosso "fita-FISH" abordagem pode fornecer amostragem simples e rápido e detecção de Salmonella em superfícies de tomate. Temos também utilizado esta abordagem para a amostragem de outros tipos de produtos frescos, incluindo espinafre e pimentas jalapeño.

Protocolo

1. Amostragem de superfície com fita adesiva estéril

1. Selecione uma fita de usar para a amostragem. O comercialmente disponíveis Fungi Tape-Con-Tact ou-It fitas de amostragem são estéreis e, especialmente embalados para facilidade de uso. No entanto, descobrimos que transparente (translúcido) fita escritório genéricos também podem ser usados.
2. Use um marcador permanente para desenhar um centímetro ² quadrados do lado não-pegajosa de um pedaço de 10 cm de fita adesiva (um modelo de papel pode ser usado). Isso servirá como um guia visual para notar que parte da fita foi utilizada para a superfície da amostra de alimentos ou ambiental.
3. Formar um "C" em forma de laço de fita, com o lado adesivo virado para a superfície a ser amostrada. Para fazer isso, segure as pontas pegajosa com o polegar eo dedo médio ea posição do dedo indicador contra o quadrado desenhado na parte de trás (não-pegajosa lado) da fita (Figura 1).
4. Coloque a fita sobre a superfície a ser amostrada e pressione suavemente a área marcada contra a superfície. Sem soltar as bordas da fita, use o dedo indicador para garantir que o lado adesivo da fita vem em pleno contacto com a superfície da amostra, evitando bolhas.
5. Usando um movimento uniforme, puxe lentamente a fita de distância da amostra, extração fisicamente ligado à superfície micróbios. Aperte a fita de células-carregada, lado adesivo para cima, sobre uma lâmina de vidro com fita de escritório genérico transparente. Garantir a tensão adequada / alongamento da fita de modo que uma superfície plana, não-wrinkly é criado. Isso ajudará a minimizar problemas com a deformação / ondulação da fita durante o aquecimento subseqüentes durante a hibridização.

2. Em fase sólida e Enriquecimento Miniculture superfície do líquido

1. Fase sólida enriquecimento é realizada por colocar a fita de face para baixo sobre xilose-lisina-Tergitol 4 (XLT-4) placas de ágar para que as células da amostra são colocados em contato direto com a superfície do ágar. A porção de contato templated / amostra da fita é colocada nivelada com a superfície do ágar e uma final da fita é vagamente aderido à parede lateral da placa de Petri para facilitar a remoção fácil da fita da superfície do ágar seguintes enriquecimento.
2. Placas são invertidas (para evitar a condensação) e incubadas a 35-37 ° C para permitir o crescimento suficiente de Salmonella spp. A duração do período de incubação necessário para enriquecer as células a um nível detectável dependerá dos níveis de contaminação inicial Salmonella. Temos observado a formação microcolony excelente inóculos inicial baixa após 8 h de enriquecimento.
3. Após o período de enriquecimento desejado, abra a placa de ágar. A fita vai manter a sua aderência durante a incubação. Pressione suavemente a fita contra o agar usando o dedo indicador para assegurar a recuperação máxima de microcolônias formada na interface de fita-ágar. Segure a fita da borda fixada na parede da placa de Petri e removê-lo com um processo lento, movimento, mesmo. Montar a fita de células-carregada, lado adesivo para cima, sobre uma lâmina de microscópio, como descrito no ponto 1.5 acima. Proceder à "fixação ea desidratação" passo abaixo.
4. Para miniculture superfície líquida, comece a fixação da fita utilizada para a amostragem em uma lâmina de microscópio, como descrito no ponto 1.5 acima. Em seguida, cobrir a parte de contato templated / amostra da fita com uma câmara de perfusão não estéreis silicone (Coverwell, Grace Bio-Labs, Inc.), formando uma câmara selada cujo fundo é formado por células da fita carregada, virado para cima. Firmeza, mas pressione suavemente a câmara no lugar para garantir uma vedação estanque.
5. Usando um gel flexível carregamento pipeta ponta, transferência ≤ 500 mL Trypticase Soy Broth ou meio de enriquecimento outro material adequado através de uma das portas da câmara pequena enseada. Seal ambas as portas com fita adesiva transparente de escritório para evitar a evaporação slides e incubar a 35 -37 ° C, conforme necessário para o enriquecimento suficiente. Apesar de todas as operações devem ser realizadas de acordo com boas práticas de amostragem e manuseio, a esterilidade de porta-fita de vedação ou câmaras de perfusão não é necessária durante miniculture superfície do líquido. A combinação de FISH e citometria de fluxo permitirão clara discriminação de Salmonella spp. de não-alvo bactérias que podem estar presentes, com a maior contribuição de não-alvo flora deverá vir da própria amostra. Proceder à "fixação ea desidratação" passo abaixo.

3. Fixação e desidratação

1. Para amostragem de superfícies directo ou para o enriquecimento da fase sólida de Salmonella spp. na XLT-4 agar, executar em fita de fixação das células por 30 min a 25 ° C, cobrindo a área de contato da amostra com 500 mL de 10% neutro tamponado.
2. Descartar fixador em um recipiente lacrado (sob um capuz químico para minimizar a exposição a irritantes / tóxicas vapor).
3. Desidratar em série etanólica (50%, 80% e 95%, 300 mL / 3 min cada concentração). Proceder à "hibridização" passo abaixo.
4. Para fixação da amostra de 500 mL miniculture superfície líquidas, câmaras de perfusão são selados, e um gel flexível carregamento de ponteira é usada para extrair o enrichate. Pipetagem rápida cima e para baixo é usado para ajudar a garantir a remoção eficaz de qualquer restante de fita-bound células.
5. Em seguida, todo o volume de 500 mL miniculture é transferido para um tubo de microcentrífuga e girou para baixo a 2.000 xg (5 min). O sobrenadante é descartado, o pellet é agitadas vigorosamente durante 30-60 s, então ressuspenso em um volume igual de 10% neutro tamponado. Células são fixadas por 30 min a 25 ° C.
6. Fixador, ao lado é removida ea amostra é ressuspenso em tampão de armazenamento de células, como se segue. A amostra é girada para baixo em 2000 xg (5 min, 25 ° C) o sobrenadante é descartado, o pellet é agitadas vigorosamente por 30 - 60 s, o ressuspenso em um volume igual de 50% não desnaturado etanol 50% de fosfato solução salina. Células fixas podem ser armazenadas indefinidamente (anos) a -20 ° C. Nota: Sempre que líquidos forem alterados (por exemplo, ao introduzir um buffer de fixador ou diferentes), é importante completamente ressuspender (com vórtice) o pellet celular em uma parcela mínima (~ 10-20 mL) de líquido do sistema "de saída" . Isso ajudará a evitar aglomeração e garantir que as suspensões até mesmo de células individuais são obtidos. Proceder à "hibridização" passo abaixo.

4. Hibridização

1. Prepare hibridação / tampão de lavagem usando o comercial de biologia molecular grau soluções observado na Tabela Materiais. Concentrações componente final do buffer é 0,7 M NaCl, 0,1 M TRIS [pH 8,0], 10 mM EDTA, sulfato de sódio 0,1% dodecil, fez até o volume final desejado com grau molecular da água e filtrada através de uma seringa de 0,22 mM ou filtro de copo. Mesmo tampão, sem adição de sondas (veja abaixo) é usado como um tampão de lavagem. Pré-aqueça hibridação e lavagem buffers a 55 ° C.
2. Adicionar fluorescente marcado Sal3 (Nordentoft et al, 1997;. 5'-AAT CAC TTC ACC TAC GTG-3 ') e Salm-63 (Kutter et al, 2006;. 5'-TCG ACT GAC TTC AGC TCC-3' ) sondas de oligonucleotídeos (Tabela de Materiais) para tampão de hibridação pré-aquecido. A sonda concentração total de 5 ng mL ^-1 é usado (por exemplo, 2,5 ng mL ^-1 sonda cada; Bisha e Brehm-Stecher, 2009a).
3. Para amostras de enriquecimento direto-para-fita e em fase sólida, sobreposição da área de contato templated amostra da fita com 300 mL de tampão de hibridação contendo o coquetel sonda e hibridizar fita-bound células em uma câmara de incubação úmida, selado definido para 55 ° C. Se uma incubadora de contato direto, como o instrumento Moat Slide (Tabela de Materiais) é utilizado, as amostras são hibridizadas por 15 min e> 20 slides podem ser processados ​​simultaneamente. Se um forno rotativo de hibridização de estilo, como o instrumento Bambino (Tabela Materiais) é utilizado, slides são colocados em tubos de polipropileno de 50 mL de centrífuga para a hibridização, um slide por tubo. Porque a transferência de calor não é direta, estas amostras são hibridizadas por períodos mais longos (até 30 min).
4. Após a hibridização, as lâminas são removidas ea sonda contendo sobreposição de tampão de hibridação é descartado. Slides são então brevemente e gentilmente lavada com tampão de lavagem pré-aquecido por pipetagem de um pequeno volume de tampão sobre uma lâmina inclinada (3 lavagens de 300 mL cada), ou formalmente lavados (até 30 min) ou com uma sobreposição de tampão de lavagem pré-aquecido ou imersão em um tubo de centrífuga de 50 mL de polipropileno contendo tampão de lavagem pré-aquecido. Em nossa experiência, apesar de uma lavagem formais irá proporcionar melhores resultados (menos névoa da sonda não ligada), um simples enxágüe é adequado para a detecção inequívoca de Salmonella spp. Em seguida, as lâminas são secas ao ar antes de passar para a "detecção" passo abaixo.
5. Hibridização de amostras miniculture superfície líquida é realizada girando para baixo amostras (recém-fixados ou mantidos em buffer de armazenamento a -20 ° C) por 5 min a 2.000 xg, seguido por vórtex vigoroso da pelota e ressuspensão em 100 mL tampão de hibridação contendo pré-aquecido o coquetel de sonda. As amostras são hibridizadas a 55 ° C por 30 min em um bloco de aquecimento ou da estação de incubação outro material adequado (Tabela de Materiais), seguido pela adição de 500 mL de tampão de lavagem pré-aquecido. Tal como acontece com fita-bound amostras, estas amostras podem ser formalmente lavados por até 30 min de incubação com mais de 55 ° C neste tampão de lavagem, com vórtex intermitente. Alternativamente, as amostras podem ser bem agitadas após a adição de 500 mL de tampão de lavagem pré-aquecido, seguido pela colheita para análise imediata (abaixo).
6. Em preparação para a detecção de Salmonella spp. através de citometria de fluxo, as amostras de líquido miniculture superfície são girados para baixo em 2000 xg por 5 min, o sobrenadante é descartado e as amostras são ressuspenso em 300 mL temperatura ambiente (~ 25 ° C) PBS. Se as amostras necessitam de transporte para uma unidade distante, ou se o atraso é esperado entre hibridização e análises, as amostras podem ser refrigeradas ou mantidos em gelo antes da analise. Alternativamente, as amostras podem ser transferidos para o buffer de células de armazenamento (50:50 mistura de PBS e etanol absoluto) e realizada a -20 ° C por até uma semana sem perdas apreciáveis ​​em sonda-conferidos fluorescência (Bisha e Brehm-Stecher, 2009b) .

5. Detecção

1. Em fita para a detecção de Salmonella spp. através de microscopia de fluorescência, as amostras de enriquecimento direto-para-fita ou em fase sólida são sobrepostos com ~ 10 mL Vectashield meio H-1200 de montagem contendo a contracoloração nuclear 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), montado com uma lamínula, então incubadas no escuro por 10 min.
2. Óleo de imersão é colocada sobre a lamínula, e as amostras são analisadas utilizando objetiva de óleo de alta ampliação (63x ou 100x). O filtro DAPI é usado para levar a amostra em foco, o microscópio é então ligado ao filtro apropriado (verde ou vermelho, dependendo do corante utilizado para acabar com rótulo as sondas) e células de Salmonella são marcados visualmente de acordo com sua fluorescência (Figuras 2 e 3).
3. Para a detecção por citometria de amostras miniculture líquido de superfície, vários instrumentos podem ser usados, dependendo da disponibilidade local. Em nosso laboratório, PBS-suspenso amostras são transferidas para tubos de 5 mL rodada final de amostragem (BD Falcon) e examinadas em um citômetro de fluxo FACSCanto com excitação em 647 nm (Tabela de Materiais). Para as amostras enriquecidas com elevado número de bactérias totais, o "baixo caudal" setting (10 min mL ^-1) é usada e 5,000-50,000 eventos são coletados. Dados são analisados ​​utilizando programa FlowJo (versão 8.8.6, Árvore Star, Inc., Ashland, OR) ou software de análise de outro material adequado (Figura 4, painéis A e B).

6. Resultados representante

Figura 1. Uso de fita adesiva para amostragem de Salmonella spp. a partir da superfície de um tomate artificialmente contaminados.

Figura 2. Os resultados típicos para direct-to-tape de amostragem e de detecção de FISH de Salmonella Typhimurium ATCC 14028 a partir da superfície de um tomate (100 objetivo de óleo X). Um cocktail dois sonda de Texas Red sondas marcadas (Sal3/Salm-63) foi usado para rotular essas células.

Figura 3. Microcolônias de Salmonella Typhimurium ATCC 14028 formada na superfície do ágar Xilose Lisina Tergitol-4 (XLT-4) após um 8 h em fita-enriquecimento a 37 ° C. O inóculo inicial foi amostrado a partir da superfície de um tomate artificialmente contaminados. Em fase sólida de enriquecimento aumenta o número de células disponíveis para a detecção e também melhora o conteúdo rRNA celular.

Figura 4. Uso de fita adesiva para amostragem de S. enterica sorovar Typhimurium da superfície de um tomate artificialmente contaminadas, seguido por análise direta via FISH e citometria de fluxo (painel A) ou após 5 h de enriquecimento miniculture não-seletivo líquido de superfície em uma câmara de perfusão com 500 mL Trypticase Soy Broth (painel B ).

Discussão

Métodos simples e rápido para a detecção de patógenos em superfícies produzem podem ajudar a mitigar doenças transmitidas por alimentos, fornecendo dados em tempo útil e acionável. Adesiva métodos baseados em fita de amostragem têm sido usados ​​em microbiologia ambiental, clínico e alimentar desde a década de 1950 e envolvem pressionando de "Scotch" fita-de estilo para superfícies para remoção de microorganismos, seguido por exame microscópico direto ou transferência de microrganismos aderentes à mídia sólida...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fita de amostragem Fungi-Tape	Scientific Device Laboratory	745	http://www.scientificdevice.com/
Con-Tact-It fita de amostragem	Birko Corporation, Denver, CO		http://www.birkocorp.com/
Fita de escritório transparente, genérica	Vários		Deve ser opticamente transparente, ter baixa fluorescência intrínseca
Superfície de alimentos	Mercearia		localTomat– s (tomat vermelho– s na videira, não encerada ou oleada) usada aqui
Caldo de soja tripticase	Difco Laboratories	211768	Para enriquecimento de minicultura de superfície líquida não seletiva
Xilose-lisina-Tergitol 4 base de ágar	Difco Laboratories	223420	Para ágar Salmonella-seletivo (XLT-4)
Suplemento de ágar xilose-lisina-Tergitol 4	Difco Laboratories	235310	Para Ágar Salmonella-seletivo (XLT-4)
Solução de formalina	Sigma-Aldrich	HT5011	Solução a 10%, neutra, tamponada (fixador de células)
Etanol absoluto	Sigma-Aldrich	E7023	Grau de biologia molecular (desidratação pré-hibridização)
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml	Várias		livres de RNase e DNase
	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Solução de NaCl	Sigma-Aldrich	S5150	Grau de biologia molecular, solução 5M (componente tampão de hibridização)
Solução tampão Tris-EDTA (concentrado 100X)	Sigma-Aldrich	T9285	1M Tris [pH 8,0], 0,1M EDTA (componente tampão de hibridização)
Solução de dodecil sulfato de sódio	Sigma-Aldrich	L4522	Solução a 10% em água 18 megaohm (tampão de hibridização componente)
Sondas de oligonucleotídeos Sal3 e Salm-63		de DNA integradas	marcadas com 6-carboxifluoresceína (FAM) ou Texas Red (para microscopia) ou Cy5 (para citometria), purificada por HPLC
Microcentrífuga de velocidade variável	Vários		Use o diâmetro do rotor para calcular o RPM necessário para os valores de RCF descritos no protocolo
Câmara de perfusão CoverWell	Grace Bio-Lab Inc.	PC1R-2.0	de gel não estéreis
(FS MultiFlex)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	05-408-151	Pontas longas e finas para fácil acesso a pequenas portas de amostragem e manobrabilidade dentro
da câmara Bloco de calor de alumínio ou estação de aquecimento controlada com precisão	Vários		Eppendorf Thermomixer R dry block aquecimento e resfriamento shaker usado aqui
Forno de hibridização mini Bambino	Boekel Scientific	Modelo 230300	As lâminas são colocadas em tubos de centrífuga de polipropileno de 50 ml para hibridização, transferência de calor não
hibridizador de slides de fosso	Boekel Scientific	Modelo 240000	Fornece transmissão rápida e direta de calor através de lâmina de vidro
Vectashield H-1200 meio de montagem com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200	Minimiza a extinção da fluorescência durante a microscopia, fornece contracoloração DAPI
Microscópio de fluorescência	Vários		Leitz Laborlux S usado aqui
Câmera digital	Várias		câmeras Canon PowerShot A640 usadas aqui
Software de aquisição de imagem	Vários		softwares Axiovision v. 4.6 (Carl Zeiss) usados
Adobe Photoshop	Adobe		Para processamento mínimo de imagens (sobreposição de imagens tiradas em diferentes canais)
Citômetro de fluxo	Vários		FACSCanto citômetro de fluxo (BD Biosciences, San Jose, CA) com excitação vermelha (647 nm) usado
Software de análise de citometria de fluxo	Vários		softwares FlowJo v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) usados