Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מקיף & עלות מעבדה ניטור יעיל של HIV / איידס: מודל לחיקוי אפריקה

Published: October 31, 2010 doi: 10.3791/2312
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 1,2
1National Health Laboratory Services (NHLS-SA), 2Department of Molecular Medicine and Haematology, University of Witwatersrand, 3Lightcurve Films

Summary

אנטי retroviral טיפול לטיפול ב-HIV / איידס מנוטר בדרום אפריקה בקנה מידה גדול. Cytometry זרימה משולב עבור המטולוגיה (CD45), אימונולוגיה (CD4) ו ויראלי עומס המקושרים CD38 assay. הוקלט ב ומסתיימת בקטן-SA מעבדות, יוהנסבורג, אלה שיטות מודרניות הן וחסכוניים עם בקרת איכות פנימית גבוהה המקומי, משמש תפקיד מודלים עבור משאב מוגבל אבחון.

Abstract

אנו מציגים את הוידאו על סיוע אנטי retroviral טיפול (ART) על ידי שירות מעבדה apt - המייצג את מודל דרום אפריקה תפקיד לבדיקות אבחון כלכלי בקנה מידה גדול. ב בעלי הכנסה נמוכה במדינות לאמנות זול הפך את סיכויי ההישרדות של חולי איידס שנושא אבל יש ספקות אם יש צורך לניטור מעבדה של ART ובאיזה עלויות - במצבים כאשר את האיכות הכוללת של שירותי פתולוגיה עדיין יכול להיות נמוך מאוד. התשובה המתאימה היא להקים שירותי קול כלכלית עם תיאום טוב יותר מחמירים הערכת איכות פנימית מאשר לראות במדינות המערב. זה וידאו, צילם במקום במעבדה שירותי בריאות ממלכתי (ומסתיימת בקטן-SA) באוניברסיטת Witwatersrand, יוהנסבורג, דרום אפריקה, מספק כגון תוכנית מתואמת הרחבת המקורי 2 צבעים CD4-CD45 אסטרטגיה PanLeucoGating (PLG). לפיכך ששת המודולים של המצגת וידאו לחשוף את הפשטות של assay 4 צבעים זרימה cytometric לשלב בדיקות haematological, החיסוני ווירולוגיה הקשורות בצינור יחיד. אלה מודולים וידאו הם: (i) הגדרת מכשירים (ii) ההכנות מדגם: (ג) בדיקת ספירת מוחלטת ואיכות ניטור עבור כל דגימה על ידי חרוז שיעור-לספור; (ד) את הבדיקה heamatological CD45 על תא לבן ספירת והפרשי; (v) ספירת CD4 ו (vi) ההפעלה של CD8 + T תאים נמדדת להציג CD38, פרמטר העומס הנגיפי בנושא. הפוטנציאל לחיסכון בעלויות, הם מרשים. הסדר זה הוא דוגמא מעולה עבור היתכנות ביצוע> 800-1000 בדיקות ליום עם בקרת איכות מחמירה מזו מיושם במעבדות המערבי, וגם עם העברה של טכנולוגיה מעבדות אחרות בתוך הרשת ומסתיימת בקטן-SA. יועצים מומחים, מנהלי מעבדה וקובעי מדיניות שנושאים את החובה לקבל החלטות על החדרת הטכנולוגיה הרפואית המודרנית הם לעתים קרובות לא בעמדה כדי לראות את הפרטים הטכניים האחרונים כפי שבוצעו במעבדות האזוריות גדול עם הנטל העצום של עומס העבודה. לפיכך וידאו זה מציג פרטים אלו התפתחויות חדשות.

Protocol

הקדמה

המאמצים המדעית המודרנית בתחום ביו להוביל יתרונות מעשיים כולל הקדמה של אבחון יעיל עבור מחלות זיהומיות. איכות גבוהה ואבחון מהיר יש צורך בגלל הסכנה של התפשטות המחלה עקב נסיעה העולמי הנוכחי ההשפעה ההרסנית של זיהומים נגיפיים וחיידקיים באזורים מוכי עוני של כדור הארץ 1.

בטיפול עניים במדינות משאב של חולי איידס עם טיפול אנטי retroviral (ART) כבר הציג בהצלחה 2,3. הפרוטוקולים של אמנות מבוססים כיום על (i) בדיקות סרולוגיות ל-HIV + אנשים, (ii) פעם ביום שילובים של משטרי התרופה הגנטית לשמש לאמנות "קו ראשון" ו - (iii) CD4 ו / או מבחני עומס נגיפי כדי להחליט מתי להתחיל לאמנות. הפרוטוקולים הם, לעומת זאת, כמו שינוי בהיקף לאמנות כעת ניתן התרחב עוד יותר עם ​​הנחיות יותר רגוע ליזום לאמנות קודם לכן ספירת CD4 גבוהה 2. חשוב לציין, להגדיל את מספר ה-HIV + חולים המקבלים לאמנות בבית CD4 גבוה + תא / μl דם אולי אפילו להאט את התפשטות ה-HIV למרות העדר הנוכחי של חיסון HIV 4, 5.

לפיכך הידבקות ב-HIV צפוי להפוך מחלה כרונית יותר ויותר ניצולים, המחייב רפואה מאורגן יותר מתמיד אך המצב הירוד של מעבדה רפואה באפריקה עדיין עשויים להישאר מחסום הבריאות יעיל 6. ישנם קולות להדגיש כי מתן מענקים לטווח קצר אינה מספקת פתרונות ברי קיימא 7-9, ו-HIV הקשורות מענקים מסופק על ידי מדינות המערב בקנה מידה הנוכחי לא יכול להימשך לנצח 8,9. בשנת 2008 USD 15600000000 הוצא על תוכניות האיידס במדינות הכנסה נמוכה ובינונית, וכ 50% מהם היו חיצוניים, כולל צפון אמריקה, מקורות. המגמות מחושב מראים כי הוצאה זו היא להגדיל עד לרמה גבוהה פי 2-3, וכי המגיפה עדיין יהיה איתנו 2031 אלא אם כן יש שינוי בגישה הכללית הנוכחית 9.

לכן מדינות אפריקה צריכה לתרום על ידי מניעת HIV טוב וחכם עלות החיסכון 9. כאן אנו מציעים כי "מודל לחיקוי" ההמצאה האחרונה לעבודה שגרתית יוקמו הציג דל משאבים מדינות (למשל באפריקה או הודו). אלה הם אזורים של כדור הארץ שבו המדענים ילמדו מלא ליהנות מתמיכה בינלאומית הנוכחי ולאחר מכן לנצל את כישוריהם כדי לשפר עוד יותר כל יום הטכנולוגיה, על ידי תרומה לפיתוח גלובלי.

ברפואה המערבית הפעילויות אבחון מרכזים אקדמיים ובתי חולים גדול הן לעתים קרובות "ממודרות", כלומר להפריד "אזורי עניין" יכולה להתקיים עבור דיסציפלינות שונות מוביל לפיצול לתוך haemato-,-viro, retroviro-, bacterio-, sero- , חיסונית, מעבדות ציטולוגית במקום לנהל גישה המאחדת שימוש מינימלי של מבחני אבחון רב תחומי במעבדה למחלות זיהומיות-. בנוסף, בדיקות אבחון יכול להיות גם יותר מדי מסובך ויקר. ברור, שירותים כאלה היו צריכים להיות מתואמים יותר טוב, אבל המאמצים הללו מאחדת צפויים לבוא לגמרי מכל הכיוונים המערבי. כתוצאה מכך, מעבדות ומכונים מובילים, כגון מעבדות שירות הבריאות הלאומי (ומסתיימת בקטן-SA) בשיתוף עם אוניברסיטת Witwatersrand ביוהנסבורג, דרום אפריקה, עומדים בפני משימה הנוסף להמשיך לפתח, לשנות, למקד מחדש ולשפר את שלהם חסכונית אבחון המבוסס על טכנולוגיה מודרנית.

בסרטון הנוכחי אנו מתארים זרימה cytometric שיטות לפקח על טיפול אנטי retroviral (ART) ב-HIV נגועים. טכנולוגיה זו מוצגת צעד חכם שישה מודולים עבור שילוב של רלוונטיים haemato-, חיסונית, מבחני virological בצינור בודד, בשילוב עם בקרת איכות פנימית חיוני (QC) כדי להבטיח שחזור של בדיקות 10. השימושים של נוגדנים חד שבטיים המועסקים כאן הם כולם מדעית מבוססת היטב. מגיב CD45 הוא עבור תא לבן ספירת דם 11-13, בשילוב עם CD4 למנות את "עוזר" לימפוציטים המהווים את היעדים העיקריים ל-HIV 12-14. זהו "טריק בונה" כי הצינור זהה את הסמן CD38 ההפעלה מזוהה על CD8 + T תאים כמו עומס נגיפי HIV-(VL) assay הקשורות 15-17. על מנת להדגיש את תרומתו דרום אפריקה, אנו מציינים כי המושגים האלה ושילובים חסכונית שלהם מעשי כולנו הסתדר ומסתיימת בקטן-העשתונות שיתופי פעולה המבוססים על טכנולוגיות מערביות המובילות 10,12,13,16,17.

מבחני אלו, בוצעו בשילוב, הם הולכים להיות נחוץ לצורך ניטור תקין של חולים אשר עוברים לטווח ארוך לאמנות. כאשר עלות efficiency הוא בחן, זו מתואמת זרימה cytometry הטכנולוגיה היא להוכיח להיות חסכוני 16,18,19. אלו יחיד צינור מבחני מייצגים לחיסכון בעלויות על גרסאות המערבי שלהם על בדיקות דומה נעשה על ידי מכשירים נפרדים ו / או ביצע בדיקות כמו פונדקאית שונים בשיטות אחרות. חסכונות אלו מפורטות בדיון.

קבלה של הטכנולוגיה בעצם פשוט זה, אשר מנצל בארבעה צבעים cytometry זרימה בצינור יחיד, חשוב להראות את הצעדים הטכניים בפורמט וידאו. יועצים מומחים, מנהלי מעבדה וקובעי מדיניות שנושאים את החובה לקבל החלטות על החדרת הטכנולוגיה הרפואית המודרנית הם לעתים קרובות לא בעמדה כדי לראות את הפרטים הטכניים האחרונים כפי שבוצעו במעבדות האזוריות גדול עם הנטל העצום של עומס העבודה. לפיכך וידאו זה מציג פרטים על ההתפתחויות החדשות הציגו בדרום אפריקה כדי לייעל את זרימת העבודה עבור בדיקות> 1000 דוגמאות קליניות בכל יום עבודה 10,13,16,17.

פרוטוקול

תזרים cytometry

הבדיקות בוצעו על ידי 4 צבעים cytometry זרימה אבל מבחני יכול גם להתבצע באמצעות 2 צבעים בשני צינורות מקבילים (ראה להלן). Beckman Coulter-XL-MCL, cytometer של fluidics יציב 21, משמש אך באותה הטכנולוגיה עשויה גם לחול cytometers אחרים. הטכנולוגיה המתוארת מטפל עומסי עבודה יומי גדול של ~ 800-1100 דגימות / יום 10,13.

מודול 1: הגדר מכשירים

תחזוקה יומית בתוך הבית היא ניקוי לבצע פעמיים ביום: ב start-up על השלמת המדגם החולה האחרון. זה כולל את השטיפה של קווי ואקום ורכישת Clenz (hypochlorite נתרן 5%; לפנה"ס, מיאמי, פלורידה). כמו כן, בסוף כל 30 שפופרת קרוסלה Clenz ומים מזוקקים מנוהלת באמצעות המערכת כדי למזער את הצטברות חלבון.

באותו יום סטארט ואקום ולחץ את הקריאות מסומנות. הוא אישר כי ספירת רקע להישאר מקובל (<100 אירועים ב 100 שניות). לאחר הפעלת דגימת הדם הראשונה נקבע כי ב aliquot של נוזל נדן שריד הוא <1%. ואז יישור לייזר ורגישות הקרינה מנוטרים יומי באמצעות מדגם של FlowCheck 21. הוא ציין כי המספרים ערוץ Mean עולות בקנה אחד (500 ± 50) עם וריאציה נמוך (חצי שיא ערכים קורות חיים <2%). פיצוי נבדקת שבועי; חרוזים FlowSet הם זממו כדי לראות אם הערכים נמצאים בתוך ערוץ אומר 1% של ערכי יעד מוגדר מראש 22. כדי לאשר את דיוק חזותית על לוי, ג'נינגס מגרשים, מספרי הערוץ מתכוון מקדם שיא מחצית (HPCV) ערכים וריאציה על ארבעה ערוצי פלואורסצנטי (FL1-FL4) מוצגים מדי יום. הבא הדיוק של ספירת CD4 הוא אישר את שתי רמות CD4. במהלך PLG-CD4 התייצב בדיקת דם תהליך שולטת (IMMUNOTROL) משמשים הרגיל נמוכה (450-700 CD4 תאים / μl) לבין רמות נמוכות (100-200 CD4 תאים / μl, בהתאם האצווה: נ"צ 23). ערכים אלה Immunotrol נדרשים להיות בתוך 0.5 SD של מתכוון עם CV% של 5% <כמבוקש על ידי BC-IQAP הבינלאומי תוכנית 24, בריטניה NEQAS 25 ו AFREQAS 26. חשוב עם אמצעים אלה מאורגן פשוט כפי שמוצג בסרטון cytometers תזרים חזק יכול לשמור את היציבות הדרושה התא הן מוחלטות כגון בדיקות ספירת CD4 ו - עבור מדידות עוצמת הקרינה לשמש סמן ההפעלה CD38. יציבות זו לאחרונה תועד בפירוט 17 המאשר מחקרים קודמים באמצעות cytometers אחרים 15,27.

במהלך תחזוקה שבועית מצב נתונים ברשימה (LMD) הקבצים בארכיון לשימוש עתידי וזה חומר לארכיון נמחק אז מהכונן הקשיח cytometer.

אחזקה חודשית כוללת את ניקוי מכולות מגיב, את נדן, clenz וטנקים פסולת. ראש קרוסלה-mode מדגם הוא ניקה בעוד כל המסננים יוסרו גם ורחץ. ניקיון זה הוארך גם לתחנות הכנה TQPrep ו PrepPlus2 (BC, פלורידה). Pipettes המשמש להכנת ידני מאומתים in-house לפחות כל 3 חודשים, אבל אם אי דיוק pipetting חשוד פיפטה נלקח מיד מתוך שירות עבור פעולה מתקנת. שישה חודשי אחזקה מתוכננת על ידי Beckman Coulter, SA.

מודול 2: הכנת דוגמאות

עבור CD45/CD4 בשני צבעים פרוטוקול PanLeucogated 5 Beckman Coulter FlowCARE ערכת 28 משמש הליך lyse-no-לשטוף (IMMUNOPREP, Beckman Coulter, פלורידה). ערכה זו מכילה CD45-והעמסת-isothiocyanate (FITC; ירוק) ו-CD4 phycoerythrin (PE, כתום). Flow-הרוזן חרוזים 29 נרכשים בכמויות מתווספים תפקיד מיוחד המפעיל ידידותי כמו numbe ידועrs חרוזים בנפח ידועים pipetted במקום לתוך המדגם 30. זה נעשה עם pipetting זהה בשימוש, כדי לספק את נפח הדם. לפיכך, שיעור הרוזן ביד (BCR) בטווח צפוי מראה כי pipetting במדגם נתון נעשה בדיוק, כפי שמתואר מודול 3 להלן. חשוב לציין כאן את השיטה pipetting פשוטה, המכונה "קדימה pipetting ', פועל בצורה הטובה ביותר, ובלבד חרוז ו דם כרכים מועברות עם פיפטה את קצה אותו עם טיפול זהה 30. מצאנו כי קדימה pipetting הניב אחידות הכוללת אופטימלי בין המעבדות, הן מבחינת מפעילי להשגת מטרות pipetting בגבולות הסובלנות מקובל שחזור של מחלק חזר כפי שנמדד על ידי וריאציה שיתוף יעיל של (% CV) 10,31,32. שיטה זו, בקונגרסים המקומיות 32, מאושר לשימוש מתחת דרום אפריקה הלאומית להסמכת Scheme (SANAS, www.SANAS.co.za) הנחיות. שימוש זה BCR חרוזים שונה volumetric השני שיטות ספירה בו בתדירות הגבוהה ביותר את המוצר חרוז lyophilized כגון ההכנות Trucount BDS משמשים אשר מכילים מספרים ידוע של חרוזים. הכנות אלה מצוינים על המסמך יציבות fluidics של המכשירים תזרים בשיעור זרימה Count (FCR) שיטה 20,31. עם זאת, השימוש מוכן חרוז המכילים צינורות עשוי הופך את הטכנולוגיה יותר מסובך, כי כאן זה חיוני כדי לספק את נפח הדם לתוך צינורות אלה עם דיוק מוחלט עליונה. יש הסכמה כללית כי למטרה זו בלבד "הפוכה pipetting" הטכנולוגיה מקובל לאחר אימון ישים. שיטת BCR שלנו היא כן, זול יותר, אינפורמטיבי יותר, פשוט יותר קל ללמוד, כפי שמוצג בסרטון -. בהשוואה לשיטות חלופיות 10,31,32 דומה אנו מוצאים גם כי מפעילי קדימה באמצעות pipetting נוטים פחות לשאוב דגימה לתוך פיפטה אשר עם pipetting הפוך יכול לגרום נזק הן מנגנון פנימי והצורך כיול מחדש וזה קשה במקומות נידחים. שיטת BCR שלנו גם obviates את הצורך במערכות pipetting אוטומטיות קטן עד בינוני בגודל מעבדות (רשימה 1).

דגימות הדם מעובדים תמיד במחלקת ארונות II Biohazard. כדי למנוע רעש רב בזמן הצילומים, הווידאו המוצג הינו השתחזרות עם חומרים בטוחים מחוץ ארונות אלה. פרוטוקול PLG-CD4 הרכישה על cytometers מאפשר זמן לעצור מגבלת זמן נתון או להמשיך לרכוש 5000 אירועים הלימפוציטים כדי לשפר את דיוק על דגימות עם ספירת CD4 נמוך.

מודול 3: שיעור הרוזן ביד (BCR)

ניטור שיעורי חרוז לספור (BCR) במערכת שלנו או כל מדגם מלאה מחושבת באמצעות הנוסחה חרוז אירועים / שניות 10,13,30,32,33. מתכוון, SD ו% ערכים קורות חיים משמשים על גיליון אלקטרוני כדי ליצור רצף העלילה לזיהוי חריגים BCR 30. אלה לאשר את הפעולה האופטימלית של שלוש מערכות של עיבוד pipetting, וניתוח המכונה אימות מדגם הכנה (SPV), מיושם הן דגימות pipetted באופן ידני או באמצעות מכשיר אוטומטי PrepPlus2 pipetting 10.

במהלך הרכישה התוצאות BCR נתפסים ישירות בזמן אמת על המסכים. על cytometers לפני הספירה ערכו של BCR מתכוון הוא 80 ± 5 אירועים / sec. אנו מראים כי סוטה BCR-s מזוהים להפעיל מחדש את התוצאות לפני המטופל משתחררים. אלגוריתם ההחלטה עץ מתוארת באיור 1 (ראה גם ref.10).

תקלות כלי מסומנים על ידי תנודות BCR כאשר להשגחה במהלך אימות דיוק האורך (LPV) כדי לזהות מגמות pipetting, דפוסים שינויים פתאומיים 10. Fluidics אימות דיוק (FPV) הוא אופציונלי in-house הליך שבו דילול יחיד של חרוזים היא aliquoted תוך 10 צינורות לרכישת סדרתי לאשר סימנים של חוסר יציבות fluidic על מכשיר פוטנציאל בעייתי 10.

מודול 4: CD45

עבור ספירת מוחלט שגרתי במחקרים שלנו דם מלא לספור מנתח LH-750 (Beckman Coulter), מכויל חודשי, יומי משמש כנקודת התייחסות עבור ספירת התאים הלבנים (WCC) נגד שבו cytometers תזרים מושווים. CD45 שנוצר WCC-s על cytometers תזרים מאומתים גם יומי על ידי השוואה עם שלוש רמות של התייצבות Beckman Coulter 5C שולטת התא כולו דם. גבולות מקובלים של הסכם WCC בין CD45 ספירת זרימה מלאה לספור מנתחי דם <5% 10. זה מעיד כי כאשר ההגבלות הן קשות יותר משאבים אז השירות שלנו יותר מאשר מכשיר אחד, כגון cytometer זרימה, כנראה מספיק כדי לספק את המתאימים קלינית WCC כולל ספירת CD4.

לבן ceספירת ההפרש יהיה מבוצעות על מנתחי haematological שונים אשר נבדלים, במיוחד בהערכת ספירת מונוציטים. דפוס הביטוי ההפרש CD45 היא להשתמש בטכנולוגיה הקלאסית של זרימה עבור ההפרש WCC 11,12, 34. כאשר הזרימה cytometer הנגזרות CD45 WCC וספירת ההפרש הם הוכיחו להיות מדויק, מדויק ויציב, אלה יכולים להיות משולבים באופן שגרתי לתוך שיטה PLG-CD4 במבחן ועשה גם זמין לרופאים ללא עלות נוספת.

חריגה CD45 דפוסי מצוינים על המגרשים פיזור CD45/side של פרוטוקול PLG-CD4 ו עקבו אחר על סרט מוכתמים בדם כדי לבקש חקירה קליניים נוספים. שיטה זו מזהה זיהום (חיידקים ווירוסים), לוקמיה ולימפומה משני שאינם נשאי HIV ו-HIV המטופלים + 34, 35. במהלך מעבדה שגרתיות מעקב HIV + חולים ספירת דם מלאה היא לעתים קרובות לא ביקש מן המעבדה ההמטולוגית. לכן נורמלי CD45 דפוסי הן אבחון כאשר ציין בגילוי לב בדגימות נשלח ספירת CD4. יתרון נוסף הוא כי ספירת CD4 מדויקת מוחלט עדיין יכול להתבצע, גם בחולים עם הממצאים של לימפומה או לוקמיה בדם 35.

תזרים CD45 הוא גם מתאים לתקנן המטולוגיה. המכשירים haematological משמעותית שונים זה מזה. אנו ממליצים מציגה את CD45 מבוססי איכות cytometric בקרת זרימה עבור הפרשי WBC להשוות ולתקנן את מנתחי haematological 10,36.

מודול 5: CD4

הפרוטוקול PLG-CD4 הציג על תוכנה Beckman Coulter XL מורכב משמונה מגרשים הדוט. מתוכם 4 משמשים כדי לקבוע את ספירת CD4 ו -4 הם לניטור איכות 12,13. בין אלה, שני הדוט מגרשים שמוצג Fig.2 חשובים. כל התאים הלבנים מזוהים באמצעות CD45 ולפזר לוואי (אזור הדוט העלילה 2) בזמן, פסולת אדום דם תאים / רוחות רפאים טסיות דם הם התעלמו. + CD45 האירועים מועברים לאחר מכן העלילה נקודות 3 שבו לימפוציטים מסוג CD4 + מזוהים ביטוי בהיר CD4 שלהם ולפזר הצד הנמוך (אזור C). CD4 + Absolute ספירת הלימפוציטים מחושבים ממספר אירועים באזור C ו-WCC (ב F הרוזן תזרים כיול באזור). הערכים עבור% של לימפוציטים מסוג CD4 מתקבלים העלילה-dot-B באזור 2. בתוקף CD4 + T לימפוציטים ואת חלושות CD4 + מונוציטים מופלים מעוצמת הקרינה-CD4 תכונות פיזור ללא צורך באמצעות נוגדן נוסף CD3 תא T ספציפיים קוקטייל מגיב (הנסקרת ב ref.13).

מודול 6: CD8/CD38

CD8-CD38 מכתים הוא חלק מכתים 4 צבעים באמצעות CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD38-PC5. CD4/CD45 זהה לעיל (Care תזרים PLG-CD4), ואת שני ריאגנטים נוספים הם CD8-ECD/CD38-PC5 הוסיף 17. אם cytometer פועל רק בשני צבעים, צינור נוסף מתווסף לבצע CD8-FITC/CD38-PE בשני צבעים מכתים, שוב באמצעות הליך lyse-no-לשטוף (IMMUNOPREP, Beckman Coulter, פלורידה). אסטרטגיה gating דומה CD4 משמש לזיהוי תאים CD8 + T עם CD8-ECD פיזור לעומת הצד (איור 3). ביטוי CD38 על לימפוציטים מסוג CD8 + הוא זמם כמו היסטוגרמה פרמטר יחיד של CD38-PC5 אומר עוצמת הקרינה (MFI) לעומת ספירת 16,17. CD38 הערכים MFI הם זממו ברצף עבור כל ביקור של המטופל אותו. הביקור הראשון (לפני הטיפול) הוא "בסיס" ערך MFI שבה כל ביקור אחר של CD38 אותו אדם של MFI מושווה 16.

בקרת יציבות מכשיר כמתואר מודול 1 מבוסס על רכישה יומית של תזרים בדוק לפקח יישור לייזר ויציבות מתח. הגדרת תזרים קובע את צבע פיצוי עבור כל ארבעה ערוצים ניאון (ראה לעיל). Immunotrol הוא שליטה "שלילית" מדגם התהליך. ה 'חיובי' שולטת הם מונוציטים בדם נורמלי להביע 9 x 10 3 CD38 מולקולות לכל תא, מדגם ידוע HIV + 17 מטופל.

הרשת של דרום אפריקה בריאות ממלכתי מעבדת שירות (SA-ומסתיימת בקטן) במעבדות אימצה את

בקרת איכות על פני שיטות סטנדרטית 70 מעבדות 13, 33 עם מסד נתונים מרכזי המכיל נהלי עבודה סטנדרטיים וחומר הדרכה. מעבדות ברשת נעזרים דיונים, הכשרה נוספת לאודישן רגיל כולל בדיקה של pipetting הטכנולוגיה 32,33. תוכנית ההערכה איכות מנוטר חודשי. באופן זה, ניהול האיכות היא לתסיבה אזורית אבל הם שמרו על סטנדרטים גבוהים עם תרומה של SA-QA ומסתיימת בקטן מחלקת 13, 26.

רשימת 1 בעלות פוטנציאל חיסכון עם cytometry בתיאום מחלת ה-HIV.:

  1. השימוש במכשיר יחיד עם היכרות חוזה שירות, במקום applying מכשירים haematological, החיסונית virological מרובים
  2. הביצועים של מבחני בצינור יחיד, ללא עלויות נוספות וללא שליחת דגימות ו ממקומות שונים כולל שתי בדיקות WCC, WBC ספירת CD4 ההפרש וניטור CD38MFI לחזות בתגובה לאמנות
  3. דיווח מיידי בתגובה לאמנות עם CD38 MFI הדיווח, שיפור משמעותי פעמים התפנית ביחס המסורתי HIV VL דיווח (בזמן אמת)
  4. השימוש בהירות הקליניים של הערכה המשולבת של התוצאות על טפסים ודיווח אותו
  5. הצורך בכלים pipetting אוטומטי יכול להיות שלל כשיטה פשוטה של ​​"קדימה pipetting" משמש את דגימות מנוטרים על ידי BCR,
  6. במהלך המבצע, טיפול מדויק של דגימות מזוהה ואת תוצאות הבדיקה בעייתית הן לתקן לפני התוצאות מורשים
  7. ניהול פרואקטיבי מונעת על תקלה במכשיר המוביל ההזמנה שירות מוקדם לפני התרסקות קשה
  8. במקרים של אבחון צפויה / לימפומה ולוקמיה במהלך פעילות שגרתית השירות
  9. הרחבה של טכנולוגיית זרימה דומה phenotyping ניטור לוקמיה
  10. תיאום מבחן CD38 עם אחסון של כתמי דם יבשים (DBS) לבדיקות VL-HIV בכל החולים ועלויות חיסכון ידי שליחת DBS להערכה רק אם יש סימנים קליניים או CD38 לעשות זאת
  11. טכנולוגיית זרימה דומים להחליף אינטרפרון-γ ELISpot שיטת מבחני שחפת
  12. בקרת איכות עבור מעבדות הפריפריה אשר מבצעים את "נקודה של טיפול" CD4 בדיקות
  13. חיסכון העלויות של ריאגנטים "לא רצויות" כגון נוגדנים CD3 וסמנים משנה (אבל במקום רכישת CD38)
  14. הרכישה גורפת של חרוזים זולים לבדיקות BCR (במקום לקנות יקר מראש pipetted ספירת שפופרות)
  15. בעוד המשא ומתן רשת משותפת מחירי בתפזורת יתרון עם חברות מסחריות

איור 1
באיור 1. החלטה עץ / אלגוריתם המשמש כאשר נבדק מדגם מראה תוצאה הפריפריה שיעור לספור חרוז (BCR). המשימה העיקרית היא להוציא שגיאה pipetting לעומת כישלון volumetric לסירוגין. התרשים מראה את הסיבות של טעויות. הוא ציין גם כי בפרוטוקול אשר היסטוגרמות וסטטיסטיקות מושפעות 10.

איור 2
איור 2 דוגמה פרוטוקול CD4 PLG המשלבת CD45-FITC (ירוק; ציר x). לעומת פיזור לוואי (מורכבות; ציר y) ו-PE CD4; (תפוזים, ציר ה-X) לעומת פיזור הצד ( מורכבות; ציר y). א 'השער הוא אוכלוסיית התאים הלבנים עם שער של הנבחרת ב' לימפוציטים. א 'השער מועבר התרשים השני מימין על מנת לזהות את הלימפוציטים מסוג CD4 +' C 'שער.

איור 3
איור 3 השילוב של assay CD45/CD4 panleucogating. (בדיאגרמות '2 'ו - '3': ראה גם Fig.2) עם assay CD8/CD38 (בדיאגרמות '4 'ו '6). כאשר leucocytes הכולל (א 'שער) מועברים '4 תרשים', כאן לימפוציטים CD8 + הם מגודרת על בסיס CD8-ECD ("x'ציר) ולפזר צד (" y'ציר, כפי שמוצג ב 'ד' שער). ואז CD8 התאים + מועברים '6 תרשים 'כדי להמחיש את עוצמת CD38-PC5 מכתים בתרשים פרמטר יחיד. זה מוצג כ 'G' פרמטר בתרשים '6 '. ממוצע עוצמת הקרינה CD38-PC5 (MFI) נרשם. ביום לאמנות ערך זה יורד בהדרגה 16,17.

Discussion

בשנים האחרונות תוכניות צדקה מונחה ולהעניק-הוקצו סייעו בהקמת כמה שיטות קליניות מצוינות בתחומים משאב מוגבל של כדור הארץ עם עומס גבוה ב-HIV. התוכניות לאמנות הצליחו לצמצם את התמותה כיום להיות יזם ב CD4 גבוה ספירת 2,3. יש כבר סימנים אלו אמצעים חדשים יקטין את התפשטות זיהום HIV 4,5, למרות העדר חיסון ל-HIV ספציפי. במסמך שלנו וידאו שכאשר מטופלים על ניטור לאמנות, טכניקות אלו יכולות להיות ממוקדות יותר ולהיות חסכונית יותר מזה שנצפה בפועל שגרתית המבוצעת במערב מעבדות (רשימה 1).

גישה כזאת אפריקה בראשות עשוי להיות חיוני כדי לתמוך בשדרוג שירותי מעבדה בזמן HIV, שטופלו לאמנות, הופכת למחלה כרונית. ניטור כזה של אמנות דורש CD4 מדויקת לספור עומס נגיפי הטכנולוגיה בנושא, משימה תובענית יותר פשוט לבצע CD4-count עבור הצבת חולים לקבוצות שרירותית על מנת לסייע החלטה על התחלה ART 16. בעזרת אבחון אלה, כלומר באמצעות מבחן CD8/CD38, ניתן לצמצם את העלויות הקשורות VL ניטור 60%> המטופלים על ART 16,19. חשוב גם להדגיש כי זהו מבחן CD8/CD38 16,17, ולא לספור CD4 37, אשר צפוי להרים סימנים מוקדמים של VL ריבאונדים ו / או חוסר תאימות החולה לקחת את התרופה.

מרכיב חיוני של שירות יעיל וחסכוני מתואמת המרכזי הוא הזמינות של רשת בקנה מידה ארצי או אזורי נתמך על ידי מומחים ויועצים אקדמיים המכירים את ההיבטים הטכניים רפואי המבצע. זו באה לידי ביטוי בפעילות הרשת דרום אפריקה ומסתיימת בקטן ואת CD4-PLG.net תוכניות הכשרה 33, 36 אשר מספקים, עידוד החינוך הערכת איכות עבור מוקדי קטנים אלה עשויים לכלול גם "טעם של טיפול" שירותים.

חשוב לציין, את פעילותן של מעבדות מרכזי נקודה של טיפול משלימות. בעוד שהראשונים יש תפקיד כפול של מתן חסכונית בקנה מידה גדול המבצע השירות וכן הכשרה בסיסית / מתקדמת במעבדות היקפי 33,38, האחרון תורם כדי לבדוק את התפשטות לאמנות ידי גיוס HIV + חולים אשר זכאים ART מבסיס גדול יותר, כולל מרפאות כפריות. הנה כמה זהירות הכרחי משום נקודה של טיפול אבחון יכול להיות הרבה יותר יקר לא ערובה אוטומטית דיוק 38. לכן זה הגיוני לשמור את המערכת בשתי שכבות וגם כדי להקל על תיאום בין שני היציעים מבלי לאפשר הזרוע או לדעוך.

לסיכום, בתחום של ניטור וניהול של האבחון הקליני של מחלות זיהומיות הכרחי לחיסכון בעלויות ניתן להשיג על ידי שירותי apt כי השימוש בטכנולוגיה מודרנית פחות יקר מתואמת יותר עם ​​איכות משופרת באופן משמעותי 13,39. ובכן מאורגן לאומי (ואזוריות) להוראות שירות האבחון צריך להיות נתמך על ידי הימנעות טוב 6-8 תרחיש כאשר כמעט כל תמיכה מענק מבוזבז על שיטות יקר ו / או נוסה בהקדם אלה מיובאים ממדינות עשירות ללא זהיר מראש ביקורת בונה מנע. באופן דומה, עיצוב גמיש יותר של ניסויים קליניים טיפולית עם מעורבות מלאה של רופאים מקומיים ואנשי הבריאות צריך להוביל לירידה של תכופים שלא לצורך ו / או יתר שאפתני בדיקות מעבדה 3. מדיניות זו תיתן סיכוי יותר לניצול מלא יותר של תוצאות זמין אבחון מדויק בהערכת קליני / מעבדה מתואמת של חולים על אמנות. אלה אבחון חכם יכול להיות גם חלוץ עבור משאבים לעניים במדינות 8 בתחומי שחפת leukaemias באמצעות הפלטפורמה הקיימת תזרים מוכר cytometric 40.

Disclosures

זכויות פטנט בינלאומי CD4 השיטה המתוארת כאן נמצאים בידי ומסתיימת בקטן דרום אפריקה כיום תחת רישיון BCI, מיאמי, פלורידה, ארה"ב.

Acknowledgments

תודה מיוחדת בשל מעבדת שירות הבריאות הלאומי (ומסתיימת בקטן) של הרפובליקה של דרום אפריקה בארגון הלאומי של השירותים הקשורים ב-HIV תזרים אבחון (http: \ \ www.nhls.ac.za ו http://www.plgcd4 . נטו). המחקרים הוצגו בוצעו במחלקה Haematology ומולקולרית לרפואה, אוניברסיטת Witwatersrand (יוהנסבורג, דרום אפריקה, נתמך על ידי ראש המחלקה, פרופ 'וונדי סטיבנס). החוקרים לא קיבלו תמיכה מענק עבור פרסום זה מחברות מסחריות או סוכנויות מימון. והעמדות המבוטאות בו הן של המחברים בלי בהכרח משקף את הדעות של המוסדות מאוניברסיטת Witwatersrand או ומסתיימת בקטן דרום אפריקה.

References

  1. UNAIDS Report on the global HIV/AIDS epidemic. , Available from: http://www.unaids.org/en/ KnowledgeCentre/HIVData/GlobalReport/2008/2008_Global_report.asp (2008).
  2. World Health Organization Rapid advice: Antiretroviral therapy for HIV infection in adults and adolescents. , Available from: http://www.who.int/hiv/pub/arv/rapid_advice_art.pdf (2009).
  3. Mugyenyi, P. DART Trial Team. Routine versus clinically driven laboratory monitoring of HIV antiretroviral therapy in Africa (DART): a randomized non-inferiority trial. Lancet. 375, 123-131 (2009).
  4. Donnell, D., Kiarie, J., Thomas, K., Baeten, J., Lingappa, J., Cohen, C., Celum, C. ART and risk of heterosexual HIV-1 transmission in HIV-1 serodiscordant African couples: A Multinational Prospective Study. 17th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, , (2010).
  5. Montaner, J., Wood, E., Kerr, T., Yip, B., Lima, V., Shannon, K., Harrigan, R., Hogg, R. Association of Expanded HAART Coverage with a Decrease in New HIV Diagnoses, Particularly among Injection Drug Users in British Columbia, Canada. 17th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, , (2010).
  6. Petti, C. A., Polage, C. R., Quinn, T. C., Ronald, A. R., Sande, M. A. Laboratory medicine in Africa: a barrier to effective health care. Clin Infect Dis. 42, 377-382 (2006).
  7. Brown, H. Global health: Great expectations. BMJ. 334, 874-876 (2007).
  8. Crisp, N. Turning the World Upside Down. Royal Society of Medicine Press. , (2009).
  9. Hecht, R., Bollinger, L., Stover, J., McGreevey, W., Muhib, F., Madavo, C. E., de Ferranti, D. Critical choices in financing the response to the global HIV/AIDS pandemic. Health Aff. 28, 1591-1605 (2009).
  10. Lawrie, D., Coetzee, L. M., Glencross, D. K. A model for continuous quality control incorporating sample-to sample assessment of optical alignment, fluorescence sensitivity and volumetric operation fo flow cytometers. Cytometry B Clin Cytom. 78, 201-208 (2010).
  11. Loken, M. R., Brosnan, J. M., Bach, B. A., Ault, K. A. Establishing optimal lymphocyte gates for immunophenotyping by flow cytometry. Cytometry. 11, 453-459 (1990).
  12. Glencross, D., Scott, L. E., Jani, I. V., Barnett, D., Janossy, G. CD45-assisted PanLeucogating for accurate, cost-effective dual-platform CD4+ T-cell enumeration. Cytometry. 50, 69-77 (2002).
  13. Glencross, D. K., Janossy, G., Coetzee, L. M., Lawrie, D., Aggett, H. M., Scott, L. E., Sanne, I., McIntyre, J. A., Stevens, W. Large-scale affordable PanLeucogated CD4+ testing with proactive internal and external quality assessment: in support of the South African national comprehensive care, treatment and management programme for HIV and AIDS. Cytometry B Clin Cytom. 74, Suppl 1. S40-S51 (2008).
  14. Dalgleish, A. G. The CD4 (T4) antigen is an essential component of the receptor for the AIDS retrovirus. Nature. 312, 763-767 (1984).
  15. Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. 16, 83-92 (1997).
  16. Glencross, D. K., Janossy, G., Coetzee, L. M., Lawrie, D., Scott, L. E., Sanne, I., McIntyre, J. A., Stevens, W. CD8/CD38 activation yields important clinical information of effective antiretroviral therapy: findings from the first year of the CIPRA-SA cohort. Cytometry B Clin Cytom. 74, Suppl 1. S131-S140 (2008).
  17. Coetzee, L. M., Tay, S. S., Lawrie, D., Janossy, G., Glencross, D. K. From research tool to routine test: CD38 monitoring in HIV patients. Cytometry B Clin Cytom. 76, 375-384 (2009).
  18. Larsen, C. H. The fragile environments of inexpensive CD4+ T-cell enumeration in the least developed countries: strategies for accessible support. Cytometry B Clin Cytom. 74, Suppl 1. S107-S116 (2008).
  19. Glencross, D. K., Coetzee, L. M., Lawrie, D., Sanne, I., McIntyre, J. A., Janossy, G., Stevens, W. Longitudinal monitoring of CD38 activation can obviate costly viral load testing in 60% of patients on ART. 11th IUSTI World Congress, , (2009).
  20. Bergeron, M., Lustyik, G., Phaneuf, S., Ding, T., Nicholson, J. K., Janossy, G., Shapiro, H., Barnett, D., Mandy, F. Stability of currently used cytometers facilitates the identification of pipetting errors and their volumetric operation: "time" can tell all. Cytometry B Clin Cytom. 52, 37-39 (2003).
  21. Coulter, B. Flow Cytometer Alignment Verification Package insert of Flow-CheckTM Fluorospheres. Volume PN 4276179-LA. , Beckman Coulter USA. Galway. (2008).
  22. Coulter, B. Flow-SetTM Fluorospheres (Flow Cytometer Standardization Fluorospheres). Package insert of Flow-SetTM Fluorospheres. Volume PN 6607007. , Beckman Coulter USA. Galway. (2007).
  23. Coulter, B. Immuno-TrolTM Cells. Package insert of Immuno-TrolTM Cells. Volume PN 6607077. , Beckman Coulter USA. Galway. (2007).
  24. Beckman Coulter Hematology IQAP program. , Available from: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsr/support/quality-assurance-programs/interlaboratory-quality-assurance-program-iqap/index.htm (2009).
  25. UKNEQAS. United Kingdom National External Quality Assessment Service. , Available from: http://www.ukneqas.org.uk (2009).
  26. Glencross, D. K., Aggett, H. M., Stevens, W. S., Mandy, F. African regional external quality assessment for CD4 T-cell enumeration: development, outcomes, and performance of laboratories. Cytometry B Clin Cytom. 74, Suppl 1. S69-S79 (2008).
  27. Tilling, R., Kinloch, S., Goh, L. E. Parallel decline of CD8+/CD38++ T cells and viraemia in response to quadruple highly active antiretroviral therapy in primary HIV infection. AIDS. 16, 589-596 (2002).
  28. Coulter, B. FLOWCARETM PLG CD4 Reagent (CD45-FITC/CD4-PE). Package insert of FLOWCARETM PLG CD4 Reagent. , Beckman Coulter USA. Galway. (2004).
  29. Coulter, B. Flow-CountTM Fluorospheres. PN 7507992-M. , Beckman Coulter USA. Galway. (2007).
  30. Scott, L. E., Glencross, D. K. Monitoring reproducibility of single analysis, single platform CD4 cell counts in a high volume, low resource laboratory setting using sequential bead count rates. Cytometry B Clin Cytom. 67, 31-32 (2005).
  31. Storie, I., Sawle, A., Goodfellow, K., Whitby, L., Granger, V., Reilly, J. T., Barnett, D. Flow rate calibration: a new approach for performing absolute cell counts. Cytometry B Clin Cytom. 55, 1-7 (2003).
  32. Coetzee, L., Lawrie, D., Stevens, W., Glencross, D. K. Evaluation of pipetting methodology to assess precision and accuracy of single platform PLG/CD4 enumeration. 2nd SA-AIDS Congress, Durban, South Africa, , (2006).
  33. NHLS Training Manual, PLG/CD4 Workshop. , Available from: http://www.plgcd4.net/ (2008).
  34. Borowitz, M. J., Guenther, K. L., Shults, K. E., Stelzer, G. T. Immunophenotyping of acute leukemia by flow cytometric analysis. Use of CD45 and right-angle light scatter to gate on leukemic blasts in three-color analysis. Am J Clin Pathol. 100, 534-540 (1993).
  35. Mokone, G. N., Lawrie, D., Coetzee, L., Glencross, D. K. Interpretation of CD45 patterns in the PanLeucoGating CD4 test can be used for diagnosis of white cell abnormalities. Poster presentation. , (2007).
  36. Lawrie, D. The wide-spread clinical uses of PanLeucoGating technology in the HIV diagnosis oriented immunohaematology laboratory. PhD Thesis, in preparation. , (2010).
  37. Badri, M., Lawn, S. D., Wood, R. Utility of CD4 cell counts for early prediction of virological failure during antiretroviral therapy in a resource-limited setting. BMC Infect Dis. 8, 89 (2008).
  38. Peter, T., Badrichani, A., Wu, E., Freeman, R., Ncube, B., Ariki, F., Daily, J., Shimada, Y., Murtagh, M. Challenges in implementing CD4 testing in resource-limited settings. Cytometry B Clin Cytom. 74, Suppl 1. S123-S130 (2008).
  39. Denny, T. N., Gelman, R., Bergeron, M., Landay, A., Lam, L., Louzao, R., Mandy, F. F., Schmitz, J., Spira, T., Wilkening, C., Glencross, D. K. A North American multilaboratory study of CD4 counts using flow cytometric panLeukogating (PLG): a NIAID-DAIDS Immunology Quality Assessment Program Study. Cytometry B Clin Cytom. 74, Suppl 1. S52-S64 (2008).
  40. Janossy, G. The changing pattern of "smart" flow cytometry (S-FC) to assist the cost-effective diagnosis of HIV, tuberculosis, and leukemias in resource-restricted conditions. Biotechnol J. 3, 32-42 (2008).

Tags

אימונולוגיה גיליון 44 וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV); הלימפוציטים מסוג CD4 לספור ספירת התאים הלבנים CD45 הפעלת panleucogating לימפוציטים CD38 עומס נגיפי ה-HIV טיפול תרופתי (ART) בקרת איכות פנימית
מקיף &amp; עלות מעבדה ניטור יעיל של HIV / איידס: מודל לחיקוי אפריקה
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Lawrie, D., Janossy, G., Roos, M.,… More

Lawrie, D., Janossy, G., Roos, M., Glencross, D. K. Comprehensive & Cost Effective Laboratory Monitoring of HIV/AIDS: an African Role Model. J. Vis. Exp. (44), e2312, doi:10.3791/2312 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter